做实验时常常会怀疑人生：明明已经按照实验室祖传标准流程一步步操作，但仍不是每一次都能够得到理想的结果！难道实验室传承多年的protocol也有bug？
太过相信标准流程，说不定就忽视了实验中“亿些”可以优化的要点！
那么如何避免一条protocol走到黑？
Abcam打造全新内容板块，一期一篇专题内容，重点讲解热门应用WB, IHC在实际操作过程中如何避免 “刻板印象” ，让我们一起学习如何科学的根据靶标特性优化实验流程吧！
你知道，分子量较大（如分子量>100 kDa）和分子量较小(如分子量<25 kDa）的蛋白在WB实验中应该如何进行实验条件的优化吗？听说电泳、转膜这些操作对于大/小蛋白的检测是至关重要的？
以下几个问题，快速检测你是否真的了解WB优化步骤：
电泳分离胶浓度：选8%、12.5%还是15%？
转膜缓冲液中的SDS终浓度：选择0.1%还是0.2%？
转膜缓冲液中的甲醇浓度：选择20%、10%或更低浓度？
PVDF膜：选择0.22μm 还是0.45μm？
//阅读下文，查看Abcam内部实验室结果，想要快速了解大/小蛋白的正确实验操作方案！
常规电泳转膜操作步骤
01
将等量的蛋白和分子量标志物上样至SDS-PAGE 凝胶孔中。细胞裂解液或组织匀浆的总蛋白上样量为20-30 μg，纯化蛋白的上样量为10-100 ng。
02
在100 V 下跑胶1-2 小时。时间和电压可能需要优化。我们推荐按照制造商的说明进行操作。建议使用还原型凝胶，除非抗体数据表推荐使用非还原性条件。也可以使用梯度凝胶。凝胶百分比取决于目标蛋白的大小：需要根据蛋白大小选择合适的电泳胶浓度，以确保不同蛋白的迁移速率与分离程度最优。 具体可参考表1。
表1 不同分子量蛋白使用的分离胶浓度
蛋白的分子量大小 (kDa) | 分离凝胶丙烯酰胺 百分比 (%) |
4-40 | 20 |
12-45 | 15 |
10-70 | 12.5 |
15-100 | 10 |
25-200 | 8 |
03
蛋白从凝胶转移到膜
膜可以是硝酸纤维素，也可以是PVDF。用甲醇活化PVDF1 分钟，并在制备转膜层之前用转膜缓冲液冲洗PVDF。转膜时间和电压可能需要优化。我们推荐按照制造商的说明进行操作。可在封闭步骤之前用丽春红染色法检查蛋白质转膜。
转膜层的制备如下：
图 1. 制备好的转膜层示例。
大分子量蛋白实验优化方案
电泳
对于分子量较大的靶标蛋白（如分子量>100 kDa），请使用较低浓度的分离胶（例如8%）进行电泳。
至少上样20μg总蛋白进行电泳。
建议使用阳性和阴性对照。
转膜
对于分子量较大的靶标蛋白，建议在转膜缓冲液中加入SDS至终浓度为0.1%。
对于分子量较大的靶标蛋白，建议使用0.45μm的PVDF膜。
对于分子量较大的靶标蛋白，建议转膜缓冲液中使用10%甲醇或更低浓度。
PVDF膜激活完成后充分清洗，完全去除膜上残留甲醇。
建议转膜完成后使用丽春红染色，确定转膜是否成功（如果选择荧光标记检测，请确保丽春红完全清洗干净）。
转膜开始前请确认胶与膜之间没有任何气泡。
大分子量蛋白靶标示例
Fibronectin注意事项：
Fibronectin是大分子量糖蛋白，推荐使用大分子量蛋白的电泳转膜条件进行实验。
Fibronectin存在糖基化等蛋白翻译后修饰，实际检测条带可能与预测值可能不符。通常会在膜上约285 kDa位置出现拖带（如图2所示）。强烈建议不要裁膜，以防丢失目的条带。
Fibronectin可以分为血浆纤连蛋白（plasma FN）和细胞纤连蛋白（cFN）。请选择合适的实验样本，有些样本可能会出现弱表达或无表达的情况。推荐使用阳性对照，以确认实验体系没有问题。
小分子量蛋白实验优化方案
电泳
对于分子量较小的靶标蛋白(如分子量<25 kDa），请使用较高浓度的分离胶（例如15%）进行电泳。
对于分子量较小的靶标蛋白(如分子量<25 kDa），电泳时染料前沿最好不要完全跑出凝胶。
至少上样20μg总蛋白进行电泳。
建议使用阳性和阴性对照。
转膜
对于分子量较小的靶标蛋白，建议使用0.22μm的PVDF膜。
对于分子量较小的靶标蛋白，建议转膜缓冲液中使用20%甲醇。
PVDF膜激活完成后充分清洗，完全去除膜上残留甲醇。
建议转膜完成后使用丽春红染色，确定转膜是否成功（如果选择荧光标记检测，请确保丽春红完全清洗干净）。
转膜开始前请确认胶与膜之间没有任何气泡。
小分子量蛋白靶标示例
Osteocalcin注意事项：
骨钙素只有在成骨细胞发育成熟后才开始表达，因此成骨细胞前体细胞系，例如未分化的MC3T3-E1中，骨钙素的表达含量可能很低，推荐使用分化后的MC3T3-E1 全细胞裂解液作为阳性细胞对照（图4）。以下生物学标志和相关标志基因的表达可以大致判断体外诱导成骨细胞分化成熟的程度。成骨细胞中能够检测到碱性磷酸酶活性，表明细胞开始增殖，胞外基质逐渐成熟，处于分化早期；成骨细胞使用茜红素染色出现深红色产物，表明钙盐沉淀，形成矿化结节，处于分化后期。成骨相关的转录因子例如RUNX2、OSX的表达逐渐增加也能够指示成熟的成骨细胞形成。
除成熟的成骨细胞外，骨钙素还可由成牙质细胞和肥大软骨细胞合成。骨钙素在一些组织，例如大脑、肺中表达量很低，推荐使用关节软骨组织（图5、图6）作为阳性组织对照。同时可通过优化实验条件，例如增加蛋白上样量、延长曝光时间、使用超敏底物（图5、图6）等方法增强检测信号。
骨钙素是一个11kDa左右的小分子量蛋白，在WB实验中请勿裁膜，防止丢失目的条带。
CDKN2A/p16INK4a注意事项：
CDKN2A/p16INK4a是一个17 kDa的小蛋白。推荐在WB实验中使用15% SDS-PAGE胶或浓度梯度胶进行电泳，以获得理想实验结果。PVDF膜孔径选择不当和转膜时间过长可能导致无信号/弱信号.
CDKN2A/p16INK4a在不同组织细胞中的表达不同。在正常组织中几乎不表达（例如脑组织、骨骼肌组织等），主要在一些肿瘤组织中表达，如宫颈癌、乳腺癌等。
仅在部分细胞系中表达。强烈推荐添加阳性对照（HeLa、HEK-293T等），以确认实验体系没有问题。
CDKN2A/p16INK4a存在多个异构体，分子量大小为11-18 kDa，在WB实验中可能检测到多条条带现象（如图7所示）。
不要裁膜，防止丢失目的蛋白条带。
在WB实验中还遇到过那些电泳转膜问题
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