重磅干货丨TSA多重循环染色实验设计及方案优化

图1. TSA多重循环染色实验流程

1. 可常规实现4-9重，甚至更多重靶标染色

2. 不受一抗种属选择的限制

3. 检测灵敏度高，成倍提高低丰度靶标的染色信号

TSA多重循环染色实验的panel设计和优化对于获得可重复的、可靠的、高质量的数据是非常关键的。为此，

（i）将每个待测靶标的信号强度控制在动态范围内。

（ii）在对同一细胞群相同细胞定位多个marker共染时，尽可能避免过度活化的酪胺沉积导致的占位效应和/或酪氨酸耗竭，因为这会造成被TSA干扰的靶标抗体抗原识别能力下降。

（iii）避免因相邻光谱的TSA荧光染料信号没有平衡好造成的光谱遗漏效应，即信号串色。

（iv）确保循环染色轮次之间的上一轮染色抗体的去除是有效的。

（A）一抗的选择、特异性验证以及抗体最佳稀释度

（B）靶标在待检组织中的丰度

（C）TSA荧光染料亮度和稳定性

（D）多个靶标的共表达情况

（E）抗原表位对热抗体去除步骤的敏感性

（F）各个通道信号的平衡和串扰

（G）染色顺序

选用高特异性、高灵敏度、批间高一致性的一抗是TSA循环染色实验成功的第一步。相较于多抗，一般优先选择特异性更好的单抗，而Abcam 重组抗体具有高特异性、高灵敏度、高批间一致性的优势，是TSA循环染色实验的理想选择。另一方面，可以优先选择经过TSA循环染色验证的抗体克隆，Abcam 已开发了超过50个 Opal™ TSA mIHC panel，经验证的重组抗体货号数目达到340个，可以在Abcam官网应用一栏勾选mIHC即可查看经TSA mIHC验证的一抗，见图1红框。

图1 在Abcam官网筛选经TSA mIHC验证的一抗

在确定好抗体克隆号之后，需要对一抗最佳稀释度进行滴定，基于TSA的检测与常规组化酶底物显色检测的一抗最佳稀释比例可能有所不同，先确定常规组化一抗最佳稀释度，然后将该稀释度不稀释、2倍、4倍稀释结合第二个维度抗原修复pH6或pH9条件，形成6个抗体稀释度-抗原修复液 pH组合进行TSA单染测试。严格来说，如果待检组织TSA单染染色模式和特定阳性细胞密度和常规组化染色可比拟，那么即可初步确定一抗最佳稀释度和抗原修复液pH。

靶标在待检组织中的丰度可以通过查阅文献，或Human protein Atlas等数据库获得，或者通过做常规组化实验来确定。

不同TSA荧光染料亮度会存在差异，可以参考TSA荧光染料试剂盒生产商所展示的信息。一般选择亮度高的染料搭配待检组织中低表达的靶标，选择亮度低的染料搭配待检组织中高表达的靶标。

关于TSA荧光染料的稳定性数据，可以参考TSA荧光染料试剂盒生产商所展示的信息。或者通过设计实验来明确。如 Zhang, W.等报道的工作所设计，使用待检样本中确定表达的靶点的一抗及所对应的HRP偶联二抗，测试搭配不同TSA荧光染料在不经抗体去除步骤、经1轮、4轮抗体去除步骤后，检测TSA荧光染色的强度³，见图2。一般受抗体去除步骤影响最小的TSA荧光染料可安排在较前的轮次，而受抗体去除步骤影响最大的TSA荧光染料可安排在较后的轮次³。

图2 通过实验设计（a）来获得TSA荧光染料的稳定性数据结果（b）³

当有多个靶标共表达在同一细胞群的相同细胞定位，一般情况下，应：

1. 尽可能地不要把共定位的靶标染色安排在挨着的两个染色轮次，以期多于1轮的抗体去除步骤能接近完全或完全地把先染的共定位靶标抗体去除。

2. 必须测试抗体染色顺序对TSA干扰效应（即占位效应和/或酪氨耗竭）的影响¹。

3. 需要在根据荧光染料亮度、靶标丰度信息初步设计的TSA荧光染料-共表达靶标组合的基础上，进一步测试优化，以确定引起最小光谱遗漏效应和TSA干扰效应的不同TSA荧光染料-共表达靶标组合¹。

Boisson, A.等报道的工作是先确定共表达靶标染色顺序，即先测试2-plex染色不同顺序染色信号强度和阳性染色细胞密度，当2-plex染色信号强度与单染样本相当，且阳性染色细胞密度与单染样本相当的2-plex染色顺序即被确定。然后在这两个共表达靶标染色顺序确定的基础上，再测试多加一个共表达靶标的3-plex情况，同样地，当3-plex染色信号强度与单染样本相当，且阳性染色细胞密度与单染样本相当的3-plex染色顺序即被确定为后续测试的染色顺序¹。

 图3 针对共定位的多个靶标TSA循环染色顺序的优化

在确定了上述共表达靶标染色顺序后，Boisson, A.等报道的工作接着进一步设置缺一对照（即设置缺省多个单独不同靶标的一抗），以进一步优化确定引起最小光谱遗漏效应和TSA干扰效应的最优TSA荧光染料-共表达靶标组合。理想的组合将可以看到各个缺一对照样本中缺省染色的靶标通道没有信号，意味着抗体去除步骤是有效的，见图4左图黑色方框，另一方面，当在某个特定TSA荧光染料-共表达靶标组合的缺一对照中非缺省染色靶标通道信号与全靶标TSA mIHC染色信号相当，且该组合各缺一对照的阳性细胞密度与单染样本的阳性细胞密度相当，那么说明该TSA荧光染料-共表达靶标组合不会引起显著的光谱遗漏效应或TSA干扰效应¹，见图4右图。

图4 设置共定位多个靶标TSA循环染色缺一对照以评估荧光遗漏和TSA干扰效应¹

对于热抗体去除步骤越敏感的抗原表位，所对应的抗体染色步骤一般应安排在较前的染色轮次，越不敏感的抗原表位所对应的抗体染色步骤可安排在较后的染色轮次³，见图5。而有的表位在经历多次热抗体去除步骤后会表位暴露程度更高，染色信号会更强。相比于靶点的特性，抗原表位对热抗体去除步骤的敏感性更多依赖于一抗本身的特性⁴。

图5 根据抗原表位对热抗体去除步骤的敏感性、染料稳定性来设置荧光染料-靶标组合及染色轮次³

在TSA多重循环染色实验中，平衡好各个通道信号，尤其是相邻光谱的TSA荧光染料通道，将最大程度减少酪氨耗竭效应或占位效应，以及减少光谱遗漏效应¹。

以Opal™ TSA mIHC染色为例，可考虑对待检组织作TSA单染，但经历mIHC的所有抗体去除步骤循环，以模拟实际的mIHC染色，通过调整Opal™ TSA荧光染料的稀释倍数、一抗与Opal™染料组合，优化一抗、二抗使用浓度、抗体孵育时间、抗原修复条件，来获得信噪比较好、各通道信号平衡的信号强度（尤其是相邻光谱的通道），一般建议信噪比大于10:1，Opal Intensity level (OIC) 在5-20之间，如图6 ^1,4。对前述参数优化后，依旧发现通道信号偏弱，可考虑采用HRP polymer偶联二抗，或者Linker + HRP polymer偶联二抗信号放大系统¹。

图6 人乳腺癌TSA单染以评估各通道信号平衡情况¹

对于panel设计信号串色情况的评估，可对各通道TSA单染但经历mIHC所有抗体去除步骤循环，以模拟实际的mIHC染色，并评估单染信号向其它通道串色的效应¹，示例见图7。对于表型分型和表达水平评估，低于5% 信号串扰的panel设计是可被接受的¹。

图7各通道TSA单染模拟mIHC测试评估信号通道串色效应

除此以外，还需针对待检样本比较完全TSA mIHC染色、缺一对照染色、TSA单染结果，理想的panel设计和优化结果将可以看到各个缺一对照样本中缺省染色的靶标通道没有信号，意味着抗体去除步骤是有效的，而当在各个特定TSA荧光染料-靶标组合的缺一对照中非缺省染色靶标通道信号与全靶标TSA mIHC染色信号相当，且各TSA荧光染料-靶标组合各缺一对照的阳性细胞密度与单染样本的阳性细胞密度相当，那么说明panel设计和优化达到了理想的状态^1,3, 见图4。

关于染色顺序，前文已有详细介绍，不作过多展开，仅小结如下要点：

1. 一般受抗体去除步骤影响最小的TSA荧光染料可安排在较前的轮次，而受抗体去除步骤影响最大的TSA荧光染料可安排在较后的轮次³。

2. 热抗体去除步骤越敏感的抗原表位，所对应的抗体染色步骤一般应安排在较前的染色轮次，越不敏感的抗原表位所对应的抗体染色步骤可安排在较后的染色轮次³。

3. 经历多次热抗体去除步骤后会表位暴露程度更高，染色信号会更强的靶标，安排在较前的染色轮次⁴。

4. 尽可能地不要把共定位的靶标染色安排在挨着的两个染色轮次，且必须测试抗体染色顺序对TSA干扰效应（即占位效应和/或酪氨耗竭）的影响¹。

下面分享3例针对关键肿瘤免疫靶点开发的、经验证的TSA多重循环染色panel，为您的抗体panel设计和优化提供参考：

正常人扁桃体组织，染色在Leica Biosystems BOND^® RX仪器上完成，使用   Opal™ 7-color automation IHC kit (NEL821001KT, Akoya Biosciences^®)，图像扫描在Vectra Polaris上完成。

人乳腺癌组织，染色在Leica Biosystems BOND^® MAX仪器上完成，使用Opal™ 6-Plex Detection Kit (NEL821001KT, Akoya Biosciences^®)，图像扫描在Vectra 3 Imaging System (Akoya Biosciences^®)上完成。该数据和图片由ImmunoAtlas惠赠。

人肺癌组织进行九轮 TSA 多重循环染色，TG470SN（深蓝色）用作核复染剂。图像通过 TissueFAXS Spectra 全自动多光谱成像系统获得。该数据和图片由TissueGnostics Asia Pacific Limited 惠赠。