前沿 | 基于单分子定位的多色超分辨显微成像技术：综述与前景

研究背景

      荧光显微镜因其对活细胞的兼容性和标记特异性而成为生物研究中的强大工具，使研究人员能够观察生物体中的蛋白质分布和细胞器形态。然而，受限于光的衍射极限，传统的远场荧光显微镜的分辨率止步于横向200 nm、轴向500 nm，这使其难以在纳米尺度上分辨细胞和组织成分。作为超分辨显微成像技术之一的单分子定位显微镜，包括PALM/fPALM、STORM/dSTORM、PAINT/DNA-PAINT、MINFLUX等，克服了这一障碍，通过在任何给定时间随机激活一小部分荧光分子发光，来获得孤立的点扩散函数，再对其进行精确定位，并将数百万个单分子的定位结果叠加，得到超分辨率重建图像。这一开创性的方法可以将分辨率提高十倍，从而揭示细胞和组织中分子活动及结构的复杂细节。它还有潜力推动对疾病机制、诊断和治疗的研究，如癌症、阿尔茨海默症和帕金森症等。

论文导读

      作为单分子定位显微镜的扩展技术，多色单分子定位显微镜能够区分样本中用各种荧光探针标记的不同蛋白质种类，不仅能够阐明单个目标的复杂结构，还能够揭示不同荧光标记目标之间的空间关系和相互作用。尽管这一技术受到了广泛关注，但生物学家在面对其众多变体时可能会感到不知所措。本综述图文并茂地介绍了多色单分子定位显微镜的最新进展，分析了每种变体的优缺点，同时讨论了未来的发展前景。相关内容于2024年10月2日以“Multicolor single-molecule localization microscopy: review and prospect”为题发表在 PhotoniX 期刊。

主要研究内容

      本综述介绍了多色单分子定位显微成像技术（图1）的最新进展。根据数据采集类型，这一技术可分为顺序采集和同步采集。顺序采集技术包括使用不同荧光团、使用单一荧光团和Exchange-PAINT。同步采集技术包括比例分光法、光谱色散法、点扩散函数工程法和激发光调制法。本综述介绍了这些技术的优缺点，并讨论了未来的发展前景。

技术突破与创新

      顺序多色成像包括使用不同荧光团、使用单一荧光团和Exchange-PAINT。

      实现顺序多色超分辨成像最直接的方法是用激发光谱差异较大的染料标记不同的蛋白质，并通过不同的激光逐步激发成像（图2）。这一方法最早由Bock等于2007年提出，同年Shroff等对在粘附复合物中组装的各种蛋白质对进行了双色超分辨成像，发现传统显微镜中看似共定位的蛋白质实际上被分辨为独特的互锁纳米聚集体。随后，这一技术得到了广泛应用，通过揭示多种生物分子的空间组织促成了重大的生物发现。这种方法相对容易实施，并且不同通道之间的串扰较小。然而，激发光谱差异较大往往导致发射光谱差异也较大，从而产生显著的色差，需要在不同通道之间进行精确的配准，以保持纳米级分辨率。此外，非红外波段的荧光染料在单分子定位成像中表现不佳，也会影响定位精度。

      为了解决这些问题，2007年Bates等提出了利用光可切换荧光探针进行多色超分辨成像（图3B-C），每种探针由一个可以在荧光状态和暗态之间切换的报告子和一个触发报告子激活的激活子组成，通过将报告子与多种不同的激活子相连接，实现顺序多色成像。这种方法不仅减少了多色超分辨成像所需的荧光染料数量，还能够灵活选择具有优越闪烁能力的红外染料，从而有助于在每个激活通道中获取高质量的数据。然而，由于激光的非特异性激活，该方法的串扰高达10%-20%。

      为了降低串扰并简化成像方法，2014年Tam等提出通过顺序标记实现多色超分辨成像（图3D-F），利用单一荧光染料AF647标记多种靶向感兴趣蛋白的抗体。这种方法包括标记第一个靶标、获取单分子数据、用硼氢化钠淬灭样品，然后标记第二个靶标，依此类推。这种方法消除了色差，避免了不同荧光染料在同一成像缓冲液中的兼容性问题，降低了仪器成本，也有效降低了串扰。然而该方法需要多次将样品取出进行淬灭和标记，然后再返回原位，整个过程耗时费力。

      Exchange-PAINT（图4）由Jungmann等于2014年提出，利用DNA杂交的可编程性和特异性设计一个与靶标连接的对接链和一个荧光标记的成像链，从而通过这些链的结合和解离生成闪烁数据。通过顺序交换成像链的缓冲液以绑定不同的靶标，实现了DNA折纸的十色超分辨率成像。这项技术在理论上可以实现无限的多重标记，但受到较长采集时间的限制。为提高采集速度，可以使用更高浓度的成像链溶液，但需要降低背景噪声；或者提高对接链和成像链的解离速率。

      同步多色成像包括比例分光法、光谱色散法、点扩散函数工程法和激发光调制法。

      比例分光法（图5）通过采用单一波长激发光照射样品，将激发出的荧光用二向色镜分为两路，经过滤光片选择合适的波段范围后投射到相机上，根据透射-反射光强比来确定荧光分子的种类，以实现多色成像。该方法由Schönle等在2007年提出，2008年通过实验验证。早期的比例分光法主要用于区分发射光谱差异较大的荧光染料，如AF647和AF700、AF647和AF750，串扰率可降低到2%以下。由于发射光谱差异引起的色差会导致成像分辨率降低，且性能优异的染料发射光谱多集中在680 nm附近，近年来科学家开发了多种颜色匹配算法，可有效识别AF647、CF660和CF680等多种光谱相近的染料。比例分光法只需要一个激发光源，简化了仪器配置。同时，使用具有高发射光子数、低背景和适度闪烁次数的远红外荧光探针，可以确保高定位精度。然而，这种方法的串扰问题仍存在，尤其是在光子预算较低的情况下。

      光谱色散法（图6）通过在光路中加入色散元件如棱镜、光栅等，将荧光分子的光谱展宽，从而识别颜色。最早采用的色散元件是棱镜。2015年，Zhang等通过在双物镜装置中的一路加入棱镜，产生光谱色散，通过与染料光谱类比进行颜色识别，另一路则用于定位。他们使用DY634、DL650、CF660C和CF680实现了四色成像，光谱分辨率为10 nm，串扰率低于2%。2022年，Song等利用双楔形棱镜产生光谱色散，在2000个光子预算下实现了10 nm横向分辨率、1.9 nm光谱分辨率和40%光子传输效率。光栅的色散性能相比棱镜更为优越，因此也被广泛应用于光谱色散法。2016年，Dong等利用周期为150线/mm的光栅，同时获得光强比为1:3的0级和1级图像，0级用于空间定位，1级用于光谱识别。他们使用AF568和Mito-EOS实现了双色成像，空间分辨率为10 nm，光谱分辨率为0.63 nm。2020年，Song等利用周期为80线/mm的光栅，在±1级衍射方向上产生两个镜像对称的光谱图像，通过每对光谱图像质心连线的中点定位获得位置信息，根据光谱移位距离获得光谱信息，这样收集到的光子可同时用于空间定位和光谱分析，将空间和光谱分辨率分别提高了42%和10%。光谱色散法的优点是可获得荧光分子的光谱信息而不仅区分颜色，且不同通道之间的串扰率很低。缺点是光谱分辨率和空间分辨率互相制约，光谱展开越大，光谱分辨率就越高，颜色识别准确率就越高；同时，分配到每个像素的光子数减少，导致光谱的信噪比降低；占据相机靶面像素数增多，光谱更易发生交叠，导致数据失真。

      点扩散函数工程法（图7）的原理是通过柱透镜、相位掩模板、空间光调制器等元件对点扩散函数进行编码，使其形状按特定规律随轴向位置变化，通常用于Z轴定位。2014年，Broeken等提出了一种同时测量单分子位置和颜色的方法，使用空间光调制器产生一个周期为1.2 mm的大间距光栅，以在点扩散函数的主瓣周围生成旁瓣，主瓣和旁瓣之间的间距与发射波长呈线性关系，从而能够区分紧密排列的光谱。2016年，Shechtman等利用空间光调制器对红光和绿光产生不同的相位延迟，使得两种荧光分子的点扩散函数随轴向位置变化规律不同，从而实现三维双色成像。2021年，Opatovski等利用二向色镜把不同波长的光分开，分别用相位板调制点扩散函数的形状，再投射到相机的同一个区域上，根据点扩散函数随轴向变化的规律不同来区分颜色。2024年，Van den Eynde等提出Circulator，利用偏振分光器将发射光分成两路，每路再通过二向色镜进行透射或反射，生成一对分裂的点扩散函数，其旋转角度与荧光团的颜色相对应。点扩散函数工程法有效地降低了不同通道之间的串扰，但仍存在某些限制。首先，点扩散函数的形状提供了详细的定位和颜色信息，但需要占据相机靶面大量的像素，难以应用于高密度数据。其次，将这种方法扩展到更多通道时会出现困难，因为在不同波长下设计和识别具有不同形状的点扩散函数变得越来越复杂。

      激发光调制法（图8）的原理是对激发光进行波长或频率调制，根据荧光团激发特性来识别颜色。2018年，Gómez-García等使用声光调制器对不同波长的激发光进行不同频率的正弦波调制，再根据探测到的每个像素强度随时间变化的频率来进行颜色分配，从而实现了串扰率低于3%的三色成像。2023年，Wu等通过使用三个波长的激光以高频顺次激发样品，再根据每个荧光分子在对应通道的光子数来分配颜色，从而实现了四色成像，串扰率小于3%，剔除率小于35%，横向和轴向分辨率分别为8 nm和23 nm。这类方法的优点是成像通道不受限制，可达到三通道以上；缺点是需要使用多个不同波长的光源，增加了仪器成本。

观点评述

      顺序采集法促进了对生物结构的高度多重化和低串扰的研究，但采集时间较长。比例分光法仪器简单，可兼容具有优良闪烁行为的远红外荧光团，但必须进行串扰抑制，以确保颜色分配的准确性。光谱色散法可以提供详细的光谱信息，但需要在光谱分辨率和空间分辨率之间取得平衡。点扩散函数工程法能够降低通道间的串扰、优化光子效率，但容易导致点扩散函数重叠，因此需要限制单分子的成像密度。激发调制法能够区分发射光谱相似的荧光团，尽管仪器较为复杂。

      我们相信以下几个方面将进一步拓宽其在生物医学中的应用范围：①扩展到动态成像，包括针对活细胞的探针开发和密集数据的颜色分配；②扩展到大视场成像，特别是通过高功率均匀照明的集成、场依赖的单分子数据分析和图像拼接技术；③扩展到厚组织，包括与自适应光学、组织透明化和原位点扩散函数模型重建技术的结合；④扩展到更多通道，例如 5-10 个通道，可能通过使用适当的染料、结合多种成像技术和先进的后处理算法来实现；⑤扩展到多模态超分辨成像，包括偏振状态、分子运动、寿命等；⑥扩展到超高分辨率成像，包括与最小光子通量（MINFLUX）、重复光学选择性曝光（ROSE）或其他调制增强定位显微镜的结合，以实现几个纳米的分辨率。

主要作者介绍

      陈曦，女，博士研究生，2022年于青岛大学获得学士学位，目前就读于大连理工大学光电工程与仪器科学学院。主要研究方向为多色超分辨显微成像技术。

      王翔宇，男，博士研究生，2016年于齐齐哈尔大学获得学士学位，2020年于广西大学获得硕士学位，目前就读于大连理工大学光电工程与仪器科学学院。主要研究方向为超分辨显微镜的仪器优化和算法开发。

      马冬晗，女，2012年和2017年于清华大学精密仪器系获得学士、博士学位，2017-2022年在美国普渡大学生物医学工程系/化学工程系从事博士后研究，2022年入职大连理工大学光电工程与仪器科学学院，获得教授职称。主要研究方向为超分辨显微成像技术，已在Nature Methods、Nature Communications、ACS Sensors等期刊上发表高水平研究论文近20篇，授权国内外发明专利2项。入选辽宁省和大连市高层次人才计划，主持多项国家级和省部级科研项目。

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