前沿 | 高时空分辨率的荧光偶极子三维取向映射方法

研究背景

      由于细胞的高度透明性，观察其中的细胞器十分困难。通过荧光染色，生物学家可以标记特定的细胞器对其进行观察。这就类似于在一个没有光的环境中，所有人都全身都是黑色，因此寻找你的朋友就非常困难。通过让我们的朋友拿着荧光棒，我们就可以轻松地找到他们。而一个有趣的问题是：如果我的朋友手中的荧光棒的角度代表了一种信号，我们可以如何探测到这样的角度信息？

      绝大部分荧光分子在吸收或发射过程中，表现为有方向的偶极子。通过荧光偏振显微镜测量偶极子特性，能够反映靶分子的取向特性，从而为研究靶分子的空间构象和运动特性提供重要信息。

      为了打破传统荧光偏振显微镜受光学衍射限制的问题，诸多超分辨荧光偏振显微镜技术被提出，如单分子定向定位显微镜（SMOLM）和偏振调制技术（SDOM、SPoD等）。然而，SMOLM在追求高空间分辨率的同时牺牲了时间分辨率，使得快速生物成像成为一项艰巨的挑战。SDOM等偏振调制技术虽具有较高的时空分辨率，但只能求解偶极子的二维取向，缺乏解析偶极子三维取向的能力。三维取向能够提供荧光分子更全面的三维空间结构，因此，关键问题是如何打破时空分辨率和取向维度之间的权衡，实现超过衍射极限分辨率的同时，能够快速成像和解析偶极子的三维方向。

论文导读

      针对偶极子取向解析问题，北京大学未来技术学院席鹏教授团队继2016年提出二维偶极子取向映射方法SDOM（Light.: Sci. Appl., 2016），及2022年基于光学锁相探测的二维取向映射方法OLID-SDOM（Light.: Sci. Appl., 2022）后，为打破时空分辨率和三维取向维度的权衡瓶颈，开发了新型的三维取向映射显微镜（3DOM）。该方法基于他们开发的偏振结构光超分辨显微技术，把杨氏双缝干涉的原理反过来，结合光路可逆的原理，利用不同角度的条纹产生不同方向的正负一级光束。进一步，只需要把相应的负一级次光挡住，就可以产生单一方向的倾斜照明。把这一倾斜投影到z轴不同的角度，即可实现高精度的三维偶极子探测（图1）。

      通过倾斜出射激发光的偏振调制模式拓展偶极子z轴信息获取，利用FISTA算法对图像进行重建，在倒易空间结合偏振调制系数和重建结果实现偶极子取向解析，不仅可以揭示乳脂球膜的异质性，阐明λ-DNA的三维空间构象和肌动蛋白丝的结构紊乱性，还可揭示活细胞中微管的动态三维取向变化，为生物大分子的分子结构和动力学的研究提供技术支撑。相关研究成果以“Three-dimensional dipole orientation mapping with high temporal-spatial resolution”为题，于2024年3月28日发表在 PhotoniX 期刊。

主要研究内容

      本文采用Cramér-Rao bound理论模拟量化了3DOM取向求解精度的下限，考虑到激发光倾斜入射角度和器件的偏振度是保证入射光偏振态的关键参数，以理论仿真结果指导优化实验装置设置，得到了可以实现各向同性精度测量的最佳倾斜角范围和器件消光比。在宽场显微镜的框架下完成3DOM系统的搭建，从实验上验证了3DOM可以提供更全面的荧光团分子三维空间结构。在对KK114染料与乳脂球的结合3DOM成像中，证实了KK114可以用于研究生物细胞膜的异质性和膜上分子的相互作用，为后续3DOM在膜类细胞器中取向研究提供了可能性。通过3DOM成像实验解析了DNA和各种细胞骨架组织排列方式。其中，测量了λ-DNA与染料分子的3D结合模式，采用取向一致性参数解析了DNA链弯曲等形态的结构和DNA的折叠程度，表明嵌入染料可以作为精细传感器在分子水平上研究DNA结合蛋白。通过分析丝状生物样品3DOM成像过程中偶极子取向分布的差异，还确定了肌动蛋白结构异质性的分子尺度特征，这对空间排列和局部异质性的定量研究至关重要。此外，通过对活细胞中的微管的3DOM成像，为微管在体内的动态行为提供了分子维度的观测。

技术突破

      3DOM方法的示意图如图1（a）所示。利用空间光调制器（SLM）和掩膜片选择+1级光通过，然后由透镜将+1级光会聚到物镜后焦平面的非中心位置，实现从物镜倾斜出射的激发光。在图1（b，c）中，通过改变SLM上加载条纹的方向6次，实现激发光入射到物镜后焦平面不同的位置，实现物镜出射的激发光相对于荧光分子的偏振方向变化。荧光分子的吸收效率正比于激发光偏振态与偶极子之间夹角的余弦平方，具体会表现为如图1（d）中探测光强的明暗变化。在图1（e-h）中， 3DOM对两个具有不同极角的偶极子会产生不同的光强响应，可以由此光强差异分辨出不同偶极子的三维取向。

      如图2所示，3DOM以17 fps重建帧率、高空间分辨(130 nm)、高精度(~3°) 、三维取向可视化的方式，观测到DNA扭结分布空间构象。在x-y视图中，测量结果证实大多SYTOX Orange染料分子插入到DNA的相邻碱基之间，使吸收偶极矩与DNA轴呈垂直排列（图 2（a-c））。在y-z视图中，发现染料分子和z轴之间的极角是变化的，显示出类似于DNA螺旋形状的分布（图 2（d））。由于DNA弯曲控制着许多涉及基因表达的重要过程，解析的DNA弯曲成圆的结构中，存在探针不垂直于DNA轴的情况，通过参考现有的DNA弯曲模型，推测出了该DNA弯曲中可能的扭结模式。

      此外，还开展了微管蛋白的动态成像（图 3）。通过统计微管蛋白端点在80秒内的伸缩运动，研究表明方位角的变化与运动方向的变化是一致的，而极角的变化主要发生在微管蛋白端点的伸长与收缩切换时。因此极角对微管的伸缩运动更为敏感，通过这三维取向可以为观测微管端点结构变化提供新观测手段。

观点评述

      3DOM方法有效地克服了偏振荧光显微镜在使用宽场成像进行高时空分辨率和三维方向映射方面的局限性，提供了更全面的荧光团分子的三维空间结构。这不仅能够应用于区分DNA、膜细胞器以及各种细胞骨架组织的宏观形态(肌动蛋白丝和微管)，而且还可以获得结构的有序性和结合紧密度等有价值的信息。此外，3DOM的主要优点之一是它易于在现有的宽场系统中升级，适用范围广，这增强了其在不同研究环境中的可及性和可用性。可以预见未来3DOM这个强大的工具将会有助于研究人员解析复杂的细胞器结构，推动对众多生物结构和纳米级相互作用的理解，为结构生物学家、生物动力学家带来新的观察工具。

主要作者

      席鹏，北京大学未来技术学院博雅特聘教授，国际先进材料学会会士(FIAAM)，国家杰出青年科学基金获得者，科技部重点研发计划首席科学家。致力于超分辨显微成像新技术的研究。现担任Light 等五本国际学术期刊的编委。在Nature, Nature Methods等国际期刊发表SCI收录期刊论文90余篇，总影响因子大于700，被引超过6000次。2016年获得中国光学重要成果奖。2022年获得广东省自然科学二等奖（排名第二）。已授权美国专利3项，中国专利19项，编辑专著2部。多次被OPTICA（原OSA）和SPIE组织的国际会议邀请作大会邀请报告。

      李美琪，2022年获得北京大学生物医学工程博士学位，师从席鹏教授。现任北京大学生命科学学院工程师，主要研究方向为结构照明显微镜和荧光偏振显微镜，以（共同）第一/通讯作者在Nature Communications，PhotoniX，Advanced Photonics Nexus，Applied Physics Letters，Chemical Communications等期刊发表论文6篇。在国内开设了《生物荧光成像实验》课程，首次将超分辨荧光显微镜搭建引入大学课堂，曾获北京大学第二十三届青年教师教学基本功大赛一等奖，课程思政奖，优秀教案奖，最佳教学演示奖和最受学生欢迎奖。主持/参与各类基金4项。

      钟素艺，2021年至今，在北京大学攻读博士学位，师从席鹏教授，主要从事荧光偏振成像、荧光光片成像和结构光照明显微成像的研究，以第一作者/共同第一作者身份在PhotoniX，Advanced Photonics Nexus等期刊发表论文5篇，参与申请国家发明专利2项，主持/参与国家级大学生创新创业项目3项。

• PhotoniX 属同行评议、开放获取（OA）高影响力国际期刊。是中国光学工程学会会刊，由中国光学工程学会、清华大学、上海理工大学和西湖大学共同主办，由Springer Nature集团出版。上海理工大学顾敏院士和西湖大学仇旻教授担任期刊主编，庄松林院士担任期刊名誉主编。期刊拥有强大的国际编委和编辑团队。PhotoniX 主要报道国内外光学与光子学技术与信息、能源、材料、生命、精密制造、纳米、光电子器件、微纳米电子等学科交叉融合发展带来的颠覆性科研成果和最新的工程应用进展。以展现具有前沿性、多学科交叉和衍生性特点的技术为核心，成为推动国际前沿“使能技术”的平台。

• PhotoniX 已被SCI、EI、SCOPUS、DOAJ、ProQuest、CNKI、INSPEC、Dimensions等10多个数据库收录。2022年6月获得首个影响因子19.818，位列Q1区。同时进入《2022年中国科学院文献情报中心期刊分区表》，位列物理与天体物理大类和光学小类双一区，为Top期刊。中国科协首次颁布“光学工程和光学领域高质量期刊目录”PhotoniX 位列T1级。
  

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