肿瘤转移需要系统性重塑远处器官微环境，影响免疫细胞表型，群体结构和细胞间通讯。然而，我们对转移性小环境中免疫表型动力学的理解仍然不完整。今天，小编要和大家分享一篇2024年6月发表在Cancer Cell（IF：48.8）上的文章，纵向分析了自发转移性乳腺癌的PyMT小鼠模型中的肺免疫细胞，揭示了转移性免疫重塑的特征，为开发抗转移性免疫疗法提供了重要基础。更贴合临床的生信分析定制
1.在PyMT和4 T1模型中构建纵向scRNA-seq免疫细胞图谱2.PyMT转移前微环境形成与髓样TLR-NFκB炎症相关3.与原发性肿瘤不同，细胞毒性NK细胞比例在转移期间增加4.髓样CCL6和IGF1信号在肺转移中受到动态调节癌症转移是50%-90%的实体瘤患者的死亡原因，部分原因是临床上缺乏批准的专门靶向转移的治疗。先前的工作已经证明，全身性肿瘤介导的免疫重塑是转移进展所必需的。因此，通过逆转或重新定向远处器官部位的转移性微环境中的免疫失调来特异性靶向转移性疾病代表了一种有吸引力但相对未探索的策略。然而，由于大多数肿瘤免疫相互作用的临床前研究依赖于原发性肿瘤和相同来源的非恶性组织中免疫细胞表型的横断面分析，我们对免疫细胞群如何在转移性微环境中动态重塑的理解仍然不完整。促转移免疫重塑涉及免疫细胞状态、群体结构，运输模式，和细胞间通讯网络等多种变化。高通量单细胞基因组学分析可以同时测定这些关键的免疫学特征。由于转移性小环境在疾病进展期间动态重组，因此，在转移的多步骤过程中对远处器官部位的免疫重塑的纵向分析既能完善我们对转移性免疫重塑的理解，又能提出抗转移性免疫疗法开发的候选途径。1.PyMT小鼠肺的纵向scRNA-seq分析揭示了转移微环境中的免疫群体结构动力学PyMT小鼠是转移性乳腺癌的完善模型，PyMT+雌性小鼠在6-8周龄时发生乳腺肿瘤，肿瘤转移率为100%。此外，PyMT肿瘤在分子特征上类似于人乳腺癌的管腔B亚型，代表了一种用于转移进展期间免疫重塑的纵向分析的理想模型。为了纵向描绘转移性微环境中的免疫细胞组成和转录变化，使用scRNA-seq和MULTI-seq，每周分析从6至14周龄的PyMT+雌性小鼠和9周龄野生型（WT）对照分离的CD45+免疫细胞（图1A）。在质量控制之后，继续分析从29个特异性样品产生的84545个高质量免疫细胞。细胞类型注释鉴定出许多免疫细胞类型，包括四种T细胞谱系、三种单核细胞亚群、两种类型的组织驻留巨噬细胞、四种类型的树突状细胞（DC），以及嗜中性粒细胞、NK、B、增殖和先天淋巴样细胞（图1 B）。接下来，将这些数据与转移进展期间免疫群体结构的已知变化进行基准测试。由于疾病进展时间的自然变异性，选择不连续建模实验时间点，而使用相异性度量Jensen-Shannon分歧（JSD）以无偏的方式将样本计算分组为三个转移阶段：（1）来自WT和6- 9周龄小鼠的“早期”肺，（2）主要来自9- 12周龄小鼠的“中期”肺，和（3）主要来自12- 14周龄小鼠的“晚期”肺（图1C）。![]()
图1. PyMT肺免疫细胞的纵向scRNA-seq细胞分析捕获转移微环境动态变化
2.组织驻留巨噬细胞在转移前微环境中产生伤口愈合和TLR-NFκB炎症反应
因为转移需要骨髓细胞谱系的深刻肿瘤介导的重塑，接下来专注于分析肺骨髓细胞。作者鉴定了两组髓样细胞：（1）BM来源的单核细胞、中性粒细胞和迁移到肺中的DC；（2）组织驻留的巨噬细胞，如IM和AM。在IMs中，无监督聚类和差异基因表达分析区分了四种主要亚型（图2A），包括Mrc1+ IM、Cd74+抗原呈递IM、增殖性IM和Crip1+ IM。在AM中，无监督聚类和差异基因表达分析揭示了总共8种亚型，其中5种反映了已知的AM功能（图2C）。还鉴定了两种疾病相关亚型：Gpnmb+ Cd63+ AM类似于在其他小鼠肺转移模型中描述的“巨噬细胞调节细胞”或“脂质相关”AM， 和在慢性阻塞性肺病中观察到的表达金属硫蛋白的AM。最后，还检测到表达细胞因子Tnf和Cxc12、炎性体组分Nlrp3和TLR共受体Cd14的炎性AM（图2C）。![]()
图2. AM炎症和IM伤口愈合转录特征与转移前微环境形成相关
进一步使用非负矩阵因子分解（NMF）来鉴定Cd14+炎性AM的详细转录特征，发现了富集的单一组分（NMF 8）（图3A），其特征基因与经由NF-κB的肿瘤坏死因子（TNF）信号通路一致（图3D）。![]()
图3. NMF和GSEA将Cd14+炎性AM特征与TLR-NFκB炎症和CD14+“活化”MDSC联系起来
3.骨髓TLR-NFκB炎症与PyMT小鼠转移前微环境形成相关接下来，关注BM衍生的骨髓谱系：单核细胞、DC和中性粒细胞。在单核细胞中，发现在转移进展期间ncM和cM频率分别降低和增加（图4A）。此外，观察到中性粒细胞分化状态的连续性（图4 B，左）和转移进展与未成熟和过渡中性粒细胞比例增加相关（图4 B，右）。此外，中期和晚期成熟中性粒细胞特异性表达与脱粒相关的基因（例如，Igfbp6和Lrg1）和疾病相关激活基因（例如，Ifitm 1和Tspo）（图4C）。除了这些已建立的免疫特征之外，还鉴定了可能反映对炎症应答的干扰素刺激的和增殖型DC，以及观察到随时间推移cDC 1比例的降低和pDC比例的中期富集（图4D）。![]()
图4. BM衍生的髓系亚型表征揭示了多种免疫细胞的转移相关变化
对剩余骨髓区室的分析显示，单核细胞和IM簇也与NMF19和CD14+“激活”MDSC模块相关（图5A）。同样，CD14+ 炎性单核细胞和IM在中期肺中按比例富集（图5 B），NMF19和CD14+ “活化”MDSC模块评分在这些细胞类型中强烈相关（图5C），并且对NMF19标志基因的GSEA分析将该炎性转录谱与经由NF-κB的TNF信号传导相关联（图5D）。随后，使用流式细胞术检测转移进展期间肺髓样细胞中的CD14蛋白丰度，验证了上述发现，揭示了肺嗜中性粒细胞、AM和单核细胞中膜CD 14蛋白丰度随时间一致地增加（图5E）。接下来，在PyMT验证队列数据集中验证了Cd14+ TLR-NFκB炎性髓样细胞的确与转移前微环境形成相关（图5 F，左图）。此外，在这些数据中，炎性单核细胞和AM的比例在中期肺中富集（图5 F，右）。接下来，进一步评估在其他小鼠模型和原发性患者样本中是否可检测到髓样TLR-NFκB炎症的特征。同样地，使用MULTI-seq在4T1原位移植模型中纵向分析肺免疫细胞。结果显示，4T1转移进展期间的肺免疫动力学分析验证了PyMT小鼠中的许多关键发现。例如，4T1转移性进展与随时间推移中性粒细胞cM比例增加以及AM、B细胞、T细胞和cDC 1比例降低相关。然而，4T1和PyMT模型之间也存在差异。例如，在4T1数据中，TLR-NFκB炎性髓样细胞的比例主要在晚期肺中增加（图5 G，右），这可能是由于疾病进展动力学、乳腺肿瘤分子亚型和/或小鼠背景的差异。接下来，通过重新分析公开可用的scRNA-seq数据（描述了15名人类供体中的脑转移灶），评估了在人类疾病中是否也能观察到髓样TLR-NFκB炎症。聚焦在四名乳腺癌和黑色素瘤患者的数据中的APOE+ MAMs（类似于TAM），S100A8+ MAMs（类似于具有TLR-NFκB炎症特征的NMF19簇 MDSC）。结果显示，NMF 19在S100A8+ MAM中富集，但在APOE+ MAM中不富集（图5 F）。综合考虑，这些结果扩展了对髓样TLR-NFκB炎症如何动态塑造转移微环境的理解，将髓样TLR-NFκB炎症与PyMT小鼠中的转移前微环境的形成联系起来。![]()
图5. 在多种细胞、小鼠模型中检测到髓样TLR-NFκB炎症特征
4.在4T1荷瘤小鼠和人类癌症中检测到骨髓TLR-NFκB炎症淋巴细胞对转移性进展具有不同的、背景依赖性的影响。对纵向PyMT scRNA-seq数据集中的肺淋巴细胞的分析揭示了这种现象的精确分子细节。在NK细胞中，鉴定了随时间推移按比例偏向细胞毒性NK细胞的免疫调节和细胞毒性亚型（图6A）。流式细胞术和对来自肺腺癌患者的正常肺、原发性肺肿瘤、正常淋巴结和转移淋巴结样品的公开可用scRNA-seq数据的重新分析均验证了这一发现（图6B和6C）。此外，CD8+ T细胞分化随时间增加（图6D）。除了这些炎症反应，还观察到淋巴细胞免疫抑制的转移相关特征（图6E）。总而言之，这些结果表明淋巴细胞参与炎症和免疫抑制转移性微环境的形成，并表明肺和原发性肿瘤相关NK细胞在PyMT小鼠和人类疾病的转移进展过程中受到独特的调节。![]()
图6. 淋巴细胞亚型特征揭示了炎症和免疫抑制性肺转移微环境的细节
5.淋巴细胞响应并促成炎症和免疫抑制性PyMT肺转移微环境转移过程中肺免疫细胞的分析记录了肿瘤介导的免疫重塑的两个特征：免疫细胞状态和群体结构的变化。然而，转移性进展也与疾病特异性细胞间通讯模式相关。因此，进一步使用CellChat 来预测每个转移阶段的活性细胞间通讯网络的变化。首先，通过评估与髓样TLR-NFκB炎症相关的细胞因子的预测信号网络验证了CellChat预测的准确性（图7A）。随后，使用CellChat来预测在转移进展期间发生变化的信号通路，鉴定了Igf1+ IM和Igf1r+中性粒细胞之间的IGF1-IGF1R信号传导回路，其仅存在于WT和早期肺中（图7B和7C ）。最后，还观察到预测的CCL6-CCR1/2信号传导网络（图7D-7F）。![]()
图7. 细胞间通讯模型揭示了肺免疫细胞信号网络中与转移相关的变化
到这里文章的主要内容就介绍完了。总的来说，研究通过对PyMT和4T1肺免疫细胞的纵向分析鉴定了与转移进展相关的免疫细胞状态、群体结构和细胞-细胞信号传导相互作用的一系列变化。这些发现为转移微环境中的组织机制提供了新的见解，并提出了可验证的假设。更广泛地说，这一系列发现表明，纵向单细胞基因组学可以多提供一层时间背景，为失调的生物系统中发生的最早变化提供更细致入微的视角。McGinnis, Christopher S., et al. "The temporal progression of lung immune remodeling during breast cancer metastasis." Cancer Cell (2024).更贴合临床的生信分析定制
