iMeta | 南农王一鸣组揭示稻瘟病及稻曲病微生物防御机制

由植物免疫所富集的水稻穗部微生物群落防治稻瘟病以及稻曲病

引  言

有益微生物不仅在植物而且在动物和人类健康方面表现出积极作用，这为利用有益微生物改善作物健康提供了可能性。最近一项研究表明，辣椒感染尖孢镰刀菌后，细菌和真菌群落发生改变，有益细菌得到富集。有益微生物在激活植物对各种病原菌的免疫力方面起着至关重要的作用。但由于生长和防御之间的权衡，免疫力的激活总是伴随着植物生长的抑制。然而，植物有益微生物可以减弱植物免疫激活造成的生长抑制，从而保持植物生长。因此，鉴定植物相关有益微生物，研究其功能作用，为农业可持续发展提供一种潜在策略。

根际和叶际是植物直接与环境相互作用的部位，由于环境条件的不同，这些部位的微生物群落多样较强。相比之下，内生菌存在于植物组织内部区域，相对数量较低。有趣的是，内生菌的种群（OTUs）可以通过种子传递给下一代。因此，有益的内生菌被认为是一种生物控制剂，可以保护植物几代。然而，检测植物内生菌的难度较大，因为存在大量的宿主基因组DNA，这给微生物DNA的分离和表征带来了技术上的限制。此外，内生菌的生物功能尚不完全清楚。

本研究分析了在两种主要真菌病原菌侵染后水稻颖果初生阶段微生物群落组成。与未处理植株相比，病原菌侵染导致微生物群落组成发生显著变化，表明病原菌感染会改变水稻内生菌群落。为了研究这些病原菌诱导微生物的生物学功能，分离了属于7个物种的11个OTUs中的6个OTUs，它们可以直接在体外抑制稻瘟菌和稻曲菌。并且建立了一个由3个OTUs组成的简化合成群落（SynCom），这些OTUs属于Pantoea agglomerans、 Acidovorax wautersii 和 Burkholderia pyrrocinia。在实验室和田间条件下，这种SynCom对水稻具有保护作用，可以防止稻瘟菌和稻曲菌的侵染。因此，本研究证明了病原菌诱导的内生菌对水稻表现出有益作用，对提高水稻抗病性，维持水稻产量提供了新的研究策略。

结  果

真菌侵染导致子囊菌相关细菌群落的变化

水稻穗部真菌病害严重影响了水稻产量。由于病原菌感染过程中可能富集潜在的有益细菌，我们通过研究水稻孕穗期穗部微生物群落多样性，筛选病原菌侵染过程中的有益微生物，来防治水稻稻瘟病和稻曲病。在水稻孕穗期，对穗部注射无菌水（Mock）或稻瘟病菌和稻曲孢子悬浮液后48小时（图1A），此时尚未出现任何发病症状，但无症状稻穗表现出显著增强的免疫力。因此，我们推测微生物群落组成的改变是由水稻免疫所引起的。通过对穗内微生物进行测序，总共获得了141，997条高质量读数，这些读数在去除被归类为线粒体或叶绿体的OTU后，共得到282个细菌OTUs。在去除冗余OTUs后，对16S rRNA序列进行分类，共涵盖了6个细菌门，包括51个属和137个OTUs。主成分分析（PCA）显示，稻穗细菌群落在对照和真菌侵染稻穗中形成了明显不同的两个簇（图1B）。进一步分析发现，水稻稻穗细菌主要由两个门构成（图S1和表S1），其中变形菌门（Proteobacteria）占95.01%，其次是放线菌门（Actinobacteria）4.62%。丰度较高的属包括Acidovorax、Sphingomonas、Methylobacterium和Burkholderia。其中，Acidovorax的相对丰度在水稻感染稻瘟病菌和稻曲病菌后均出现增加的趋势，而Methylobacterium的相对丰度降低。值得注意的是，Sphingomonas在水稻感染稻瘟病菌后相对丰度增加，在感染稻曲病菌的样品中降低，而Burkholderia则呈现出相反的趋势。对α多样性进行评估显示，真菌病原菌侵染后细菌多样性呈现出减少的趋势，而感染稻曲病菌表现出比感染稻瘟病菌的稻穗对降低细菌多样性的影响更强（图1D），这表明植物在病原真菌侵染后，微生物多样性减少，而微生物丰度增加。

图1. 稻病原菌感染水稻穗部微生物组分析

（A）高通量细菌培养和鉴定流程。（B）基于相对丰度不同的操作分类单元（OTUs）计算的Bray-Curtis距离的主成分分析（PCA）分析细菌群落。（C）病原菌感染和非感染颖片微生物组组成的变化在种水平上。（D）通过分析Chao1指数比较了病原菌感染和非感染稻颖片的细菌多样性。值是平均±SD（5个生物重复，每个包括6株稻穗），根据配对Student’s t-检验显示每对列中的p值。（E）基于16S rRNA序列的LEfSe分析产生的分类学分支图突出了与稻曲菌处理相关的生物标志物。仅显示超过线性判别分析（LDA）显著性阈值3.5的菌群，其中每个组内的相对丰度由小圆圈表示，并在图中表示为不同颜色。黄色圆圈表示特定菌群之间处理之间丰度差异不显著。每个点的亮度与其效应大小相对应。在对照组中富集的菌群具有负LDA得分（绿色），而稻曲菌侵染中富集的菌群则具有正得分（红色）。（F）火山图显示了稻曲菌侵染后颖片中差异积累的OTUs。每个点代表一个OTU，x轴上的位置代表丰度变化倍数。虚线表示显著差异OTUs的阈值（|log₂（FC）|> 1）。蓝色点、红色点和灰色点分别代表显著富集的OTUs（上）、显著减少的OTUs（下）和无差异的OTUs。

不同真菌病原菌侵染下细菌微生物组的生物标记物类群

为了进一步了解真菌病原菌感染后微生物的变化情况，进行了线性判别分析（LEfSe），结果表明，稻瘟病菌侵染稻穗后，Pantoea和Sphingomonas被特异性富集，而稻曲病菌侵染稻穗后，Dickeya和Enterobacter 被特异性富集（图1E）。火山图分析显示了两种不同真菌病害侵染稻穗后差异积累的菌群。与对照相比，属于Acidovorax、Pantoea、Pseudomonas、Sphingomonas 和 Herbaspirilum 的5个OTUs在稻瘟菌侵染后高度富集，有11个OTUs减少（图S2C）。在稻曲菌侵染时，属于Acidovorax、Burkholderia 和 Aurantimonadaceae的3个OTUs（OTU1、OTU4和OTU11）被富集，而有17个OTUs减少（图1F）。

抑制水稻病原真菌拮抗菌株的筛选

病原菌侵染过程中，水稻通过招募有益细菌来对抗病原菌的侵染。从穗部样本中分离了189株可培养细菌中，我们选择了稻瘟病菌或稻曲病菌侵染后差异性富集菌群中的11种微生物，包括Pantoea （OTU6）、Acidovorax （OTU1）、Burkholderia （OTU4）、Delftia （OTU76）、Methylobacterium （OTU26）、Pseudomonas （OTU8）和Sphingomonas （OTU15）（图S3）。在体外拮抗试验中，P. agglomerans、P. jilinensis、A. wautersii、B. contaminans 和B. pyrrocinia对稻瘟菌（图S4A-B）和稻曲菌的生长均表现出较强的拮抗作用（图2A-B）。相反，真菌感染后减少的OTUs没有表现出生长抑制作用（图2A-B）。

图2. 具有拮抗作用和生物防治活性的细菌抑制水稻稻曲病原菌

 (A) 在共培养实验中，使用未经处理的菌株作为对照(Mock)，筛选菌株对稻曲的拮抗作用。(B) 筛选菌株对稻曲的生长抑制作用。实验独立重复三次，结果相似。(C) 筛选菌株对稻曲的生物防治作用。(D) 使用不同拮抗菌株处理水稻植株后，稻曲病的稻曲球数量发生变化。数值为平均值±SD（n=6个稻穗）。不同字母表示p<0.05，通过单因素方差分析（One-way ANOVA）和Tukey多重比较法确定差异显著性。实验独立重复三次，结果相似。(E) 田间试验中，SynCom（P+A+B）对病害抑制活性的表现。(F) 代表水稻穗上稻曲症状的图片。(G) 使用SynCom处理的病穗率。数值为平均值±SD（n=30）。不同字母表示p<0.05，通过配对Student’s t-检验确定差异显著性。(H) SynCom处理后水稻产量的统计数据。不同字母表示p<0.01，通过配对Student’s t-test（双侧）确定差异显著性。

构建抗病合成菌群

根据前期的拮抗表型试验，我们选取了三种具有较强病原菌抑制作用的细菌菌株，包括：P. agglomerans、A. wautersii 和 B. pyrrocinia，用于构建合成群落 (SynCom)。将SynCom组分以单独、成对或混合方式喷洒在水稻叶片上，并在处理后的24小时接种稻瘟病。结果显示，每个单独生防细菌处理都略微增强了水稻抗性，两种细菌组合则更显著地提高了对稻瘟病的抗性，而SynCom (P + A + B) 三菌组合对稻瘟病防治效果最好。同样地，SynCom (P + A + B)三菌组合对水稻稻曲病防治效果也比单独或成对菌株的组合要显著增强 (图2C-D)。此外，通过在秧苗移植期、分蘖期和抽穗扬花期喷施SynCom（P+A+B）对水稻进行田间试验。与未处理的植株相比，处理植株对稻瘟病菌和稻曲病（图2E-G）的抗性显著增强，水稻产量也有所增加（图2H）。综合以上数据表明，SynCom（P+A+B）的施用在提高产量的同时还能够显著提高水稻对稻瘟病和稻曲病的抗性。

讨  论

植物在整个生育周期不断遭受外界病原物的侵袭，严重限制了植物的生长。为了抵御病害，植物进化了多层免疫系统来对抗病原微生物。此外，越来越多的证据表明，植物还可以利用有益微生物来对抗病原菌的侵染。然而，目前有关有益微生物在水稻上的研究仍然有限。本研究中发现，病原真菌侵染会引发植物免疫系统的激活，进而引起水稻微生物群落的改变，导致有益微生物的富集，进而增强植物抗病性。通过对病原真菌侵染后对水稻穗部微生物群落影响以及对分离可培养有益微生物的功能研究，我们构建了有益微生物的合成群落（SynCom），证实了SynCom通过直接抑制病原真菌生长来提高水稻对稻瘟病和水稻稻曲病的抗性作用。

有关水稻不同组织部位中的微生物群落组成情况，已经进行了大量的研究。与水稻根际和根部相比，种子内部的微生物多样性程度和丰富度较低。然而，种子内部的核心微生物群落是垂直传递的，这可能对提高水稻适应性很重要。此外，种子内部菌群OTUs相对较低丰富度，多样性较低，这可能是从抽穗期收集的穗部微生物样本被茎组织紧密覆盖所导致的。因此，我们分析了水稻抽穗后，穗部完全暴露于外界环境条件的穗部微生物组。主成分分析（PCA）显示，穗部微生物的多样性显著，在抽穗前后穗部之间的距离甚至大于由真菌感染所导致的距离差距。

众所周知，Bacillus菌株常用于植物抗病的生物保护剂。最近，我们报道了水稻根际的Bacillus可增强水稻对Xanthomonas抗性。然而，我们在病原真菌侵染的水稻穗部并没有分离到Bacillus。这可能是由于穗部是水稻的生殖组织，其细胞可能由于生长和防御之间的权衡而具有相对较低的免疫力。因此，穗部可能与优先招募具有直接抗病作用的微生物。此外，水稻穗中的有益微生物招募策略可能与根和叶子等其他组织不同。特别是A. wautersii 对稻瘟菌和稻曲菌菌丝生长表现出直接抑制作用，而病原真菌处理后减少的OTUs则没有显示任何抑制作用。此外，外源应用A. wautersii也显示出对水稻对真菌病原菌抗性的增强。这与之前的发现一致，即由病原菌诱导的有益微生物组装，在根际中高度富集，可增强植物抗病性。因此，水稻可根据组织部位的不同采用不同的机制来抵抗不同类型的真菌病原菌。

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“iMeta” 是由威立、肠菌分会和本领域数百千华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表所有领域高影响力的研究、方法和综述，重点关注微生物组、生物信息、大数据和多组学等。目标是发表前10%(IF > 20)的高影响力论文。期刊特色包括视频投稿、可重复分析、图片打磨、青年编委、前3年免出版费、50万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊发行！发行后相继被Google Scholar、ESCI、PubMed、DOAJ、Scopus等数据库收录！2024年6月获得首个影响因子23.7，位列全球SCI期刊前千分之五(107/21848)，微生物学科2/161，仅低于Nature Reviews，同学科研究类期刊全球第一，中国大陆11/514！

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