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今天为大家介绍的是来自Christopher R. McMaster团队的一篇论文。世界卫生组织将抗生素耐药性列为人类健康三大威胁之一。对抗生素的需求是一个紧迫的问题，亟需引起关注。在这里，作者使用计算机辅助药物设计开发了一种结构独特的抗生素家族，其靶向全酰基载体蛋白合成酶（Acyl carrier protein Synthase，AcpS）。AcpS是一种高度保守的酶，对于细菌的生存至关重要，其催化脂质合成中的第一个步骤。据作者所知，目前没有针对AcpS的抗生素，这使得这一药物开发计划具有很高的研究价值。作者合成了一个包含700多种新型化合物的库，这些化合物针对AcpS，其中33种在体外以≤2 μg/mL的浓度抑制细菌生长。作者展示了这一类化合物在对抗广谱革兰阳性菌（Gram-positive organism）方面具有独立活性，并能与粘菌素（colistin）协同作用，以覆盖革兰阴性菌。作者展示了这些化合物在体外以及体内动物感染模型中对临床相关的多药耐药菌株的疗效，包括以人类糖尿病足溃疡感染为例的难治性缺血感染。这一抗生素家族可能成为多个多药耐药抗微生物项目的基础。
抗微生物耐药性（AMR）是指细菌进化后对现有抗生素产生免疫，使得抗生素在治疗感染时失去效力。新抗生素的需求主要是因为现有药物种类有限，许多抗生素属于少数几个特定的类别，而细菌已经发展出规避这些药物作用的机制。这种抗生素选择的缩小使得医疗人员在治疗感染时可选择的药物越来越少，增加了治疗失败的风险。据估计，目前全球每年与抗微生物耐药性相关的死亡人数约为495万，其中127万例直接由抗微生物耐药性导致。换句话说，如果没有任何耐多药（MDR）感染，495万人的生命可以得到挽救；如果所有耐多药感染都被替换为药物耐药性感染，那么可以挽救127万人的生命。
导致AMR死亡的六大主要病原体依次为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌。其中，导致最多死亡的病原-药物组合是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）。奇怪的是，尽管MRSA在目前的世界卫生组织优先干预病原体清单中被列为高度，但并没有被列为最高优先级；而另一个大量导致AMR死亡的物种——耐氟喹诺酮大肠杆菌——甚至未出现在当前世界卫生组织的优先病原体清单中。全球因疾病而死亡的榜单中，与AMR相关的死亡将排名第三，而AMR直接导致的死亡将排名第十二。
尽管如此，过去35年中仅有一个针对AMR的新化学实体（即新抗生素）获批用于临床。除了AMR的上升，下一次大流行病可能是细菌引起的。实际上，许多历史上的大流行病都是细菌性的，例如人类历史上最严重的黑死病大流行就是由鼠疫耶尔森氏菌引发的。细菌的进化是一个持续的过程，它们不断适应并获得新的抗药性机制。因此，必须通过持续开发新的抗生素，才能有效对抗这些耐药菌株。
在本研究中，作者描述了针对细菌抗生素靶点AcpS的计算机辅助药物设计过程，成功开发出了一类结构独特且易于合成的抗生素家族，这类化合物对多重耐药（MDR）革兰氏阳性菌具有广泛的疗效，并且与多黏菌素协同作用，可以扩大对革兰氏阴性菌的疗效。作者还展示了该家族中的一个化合物在动物感染模型中的疗效。这个新的抗生素家族中的其他成员可以进一步研究，作为治疗多种多重耐药感染类型的起点。
计算机辅助药物设计AcpS抑制剂
图 1
作者采用了一种全新的计算机辅助药物设计策略，旨在确保潜在的独特抗生素类别在结构上与现有抗生素有显著区别。作者选择了一个不会受到现有抗生素影响的蛋白质靶点，以降低抗生素耐药性出现的可能性。这个靶点是全酰基载体蛋白合成酶（AcpS），它是细菌中高度保守且必需的酶。AcpS是细菌脂质代谢的关键起点，通过从辅酶A（CoA）中捐献一个4'-磷酸泛酰巯基胺基团，激活酰基载体蛋白（ACP），生成全酰基载体蛋白（holo-ACP）（图1a）。作者设计了小分子抑制剂来抑制AcpS的活性，利用已有的关于酶-底物复合物的详细结构信息以及其催化机制来进行合理设计。
通过已知的AcpS晶体结构，作者首先评估了多种化学类型，识别出能够与受体口袋的空间结构精确相互作用的分子框架。随后，作者全新设计了一个小型、集中式的化合物库，用于探测活性位点的一般性疏水性和阳离子特性。该库围绕着一类合成上具有模块化的三取代（tri-substituted）五元（penta-atomic）芳香杂环（aromatic heterocyclic）化合物展开，这些化合物至少携带一个带负电的羧酸生物等排体（四唑）和一个可以在三个位置进一步修饰的中心环（噻吩）。作者通过三代“噻吩四唑”集中化合物库的开发，利用分子对接研究来指导取代基的选择。
第一代噻吩四唑主要探索了在2号和5号位引入羧酸、酯、酰胺以及疏水（单环和双环）取代基的效果。在前50个化合物的研究中，作者发现四唑基团需要保持“裸露”，并且应该是分子中唯一的可电离基团，因为所有在pH 7.4下带有更多或更少电荷的化合物在体外均表现为无活性。仅在2号或5号位进行取代会导致活性丧失，将结构环化到噻吩环上也同样如此；然而，制作二聚体工具化合物（即双噻吩四唑）却大大提高了体外的效力。作者最终得到一个具有伪对称芳基的代表性化合物DNM0213，该化合物的体外效力与二聚体相当，但其分子量更理想（373.267 g/mol）。作者认为该化合物是第一代的成果（图1b）。
接下来，作者开始了第二代伪对称噻吩四唑化合物的开发。与第一代化合物DNM0213一样，保留了2,5-二芳基修饰，但将苯基取代基进行了修改，引入了更多功能基团，旨在提供伦敦色散力（London dispersion）和/或诱导偶极相互作用，分别与活性位点中的疏水性和/或阳离子残基发生作用。这一代设计的一个关键约束是要具备穿透细菌细胞壁和膜的能力，这一特性通过结构难以直接预测。作者还探索了中央核心结构的身份或取代模式的变化，尽管苯基取代基可以被接受，但总体而言，噻吩仍是保持酶活性和增强最低抑菌浓度（MIC）的最佳选择。最终，在第三代中，作者继续优化和平衡疏水性，同时保持或提高酶的活性和最低抑菌浓度，这两者都在噻吩四唑库的设计基础上得到了显著改善（图1b）。这一优化的“最佳点”是代表性化合物DNM0547，它是对接研究中得分最高的化合物之一（图1c）。
作者的化合物均在少于六个步骤内合成，起始材料易于获得，并避免了复杂的反应条件，使其适合进行放大生产，以用于临床前/临床研究（作者已经开发了克级合成路线，并为选定的先导化合物进行了更大规模的路线发现）。总共合成了一个包含700多种化合物的库，并且已经确定了针对AcpS的显著结构-功能-活性关系。随着化合物开发的推进，抑制AcpS酶活性的效力显著提高，且通常与对广泛的革兰氏阳性菌最低抑菌浓度（MIC）的改善相对应。根据临床实验室标准研究所（CLSI）的指南，作者的抗生素家族中有33种化合物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的最低抑菌浓度（MIC）为≤2 μg/mL，并且其抑制AcpS酶活性的IC50范围为1–15 μM。
DNM0547化合物对AcpS的抑制作用
AcpS被选为潜在的新抗生素靶点，不仅因为其在细菌物种中的高度保守性。首先，AcpS的底物Km值估计为apo-ACP为1.8 μM，CoA为40 μM。CoA的高Km值意味着低μM亲和力的化合物可以有效抑制其活性。其次，AcpS对apo-ACP底物表现出底物抑制作用，因此随着AcpS活性受到长时间抑制，apo-ACP底物水平增加，抑制效果会进一步放大。作者采用了DNM0547作为这一抗生素家族的测试化合物，进行了更深入的AcpS抑制作用的表征。计算机辅助药物设计策略将DNM化合物定位于AcpS的活性位点。如果DNM0547与AcpS的活性位点结合，预计将表现出对AcpS底物的竞争性抑制。作者测定了在没有和存在8 μM DNM0547的情况下，AcpS对不同浓度CoA的活性，观察到Km值增加但Vmax无变化，这与DNM0547对AcpS的竞争性抑制一致。
对已知AcpS共晶结构的分析显示，活性位点附近的残基（定义为距CoA 4.5 Å以内）广泛保守，预测DNM0547与Arg46、Phe50和Lys63发生相互作用（基于金黄色葡萄球菌的氨基酸残基编号）。为了确定Arg46、Phe50和Lys63是否如作者的计算机辅助药物设计策略所预测的那样对AcpS活性和DNM0547结合至关重要，作者采用了这几个残基的丙氨酸扫描突变分析，以确定它们在AcpS酶活性和DNM0547抑制中的作用。如果作者预测的DNM0547结合位点是正确的，那么当这些氨基酸残基突变为丙氨酸时，其IC50值应会增加。
使用纯化的大肠杆菌AcpS蛋白，作者测定了野生型和多个AcpS突变体的酶活性。通过丙氨酸扫描突变分析的残基包括（前者为金黄色葡萄球菌残基，后者为相应的大肠杆菌残基）：R46/48、F50/50、R54/53、K63/62、N82/81和H-/108。对AcpSF50/50A、AcpSR54/53A和AcpSK63/62A的酶活性测定表明，这些突变体均无活性，表明这些残基在催化中具有重要作用。有趣的是，AcpSR46/48A与野生型酶相比表现出轻微的活性增加。作者还测试了位于活性位点但不预测参与DNM0547结合的AcpSN82/81A和AcpSH-/108A（模型预测Asn82/81与DNM0547的相互作用能量极小，并且比DNM0547的两个伪对称π系统之一远2 Å，而His108距离超过15 Å，对结合无显著作用），这些突变体仅表现出酶活性的小幅下降。
由于AcpSF50/50A突变体仍具酶活性，作者进一步确定了其对DNM0547的IC50值是否增加，这符合如果AcpSF50/50对DNM0547结合重要的预测。作者使用AcpSN82/81A和AcpSH-/108A作为对照，它们位于活性位点但不预测参与DNM化合物结合。野生型AcpS对DNM0547的IC50预测为5.1 μM，而AcpSF50/50A突变体的IC50增加至16.2 μM，而AcpSN82/81A和AcpSH-/108A的IC50分别为5.0 μM和5.6 μM，均与野生型相似。通过位点定向突变法探索预期的DNM0547结合位点，结合DNM0547对AcpS酶活性的竞争性抑制，与计算机辅助预测DNM0547结合AcpS活性位点的结果一致。
DNM化合物在动物感染模型中的体内测试
为了确定这类抗生素是否具有体内抗微生物活性，作者首先在动物模型中测试了一部分化合物，使用了一种兔子缺血性耳部创伤模型，该模型模拟了糖尿病足溃疡（DFUs）中观察到的缺血条件。现有抗生素对糖尿病足溃疡的疗效不佳，现有的局部用药也无效。对于那些由于局部血液供应受限和创伤部位缺血/缺氧而感染的患者（如糖尿病患者的腿部和足部溃疡），治疗尤其困难，因为能够到达感染部位的全身药物（如静脉或口服药物）的量依赖于正常的血管系统功能。
尽管现有的局部抗生素对DFU无效，但局部给药在治疗外周血管供应有限的缺血性感染方面具有许多优势。首先，局部抗生素直接作用于感染部位，能够实现更高且更持久的治疗药物浓度（这还具有抑制抗微生物耐药性发展的附加好处）。其次，它不需要受影响区域具备良好血管化。第三，局部吸收和全身毒性（包括肾毒性、过敏反应以及破坏人体正常菌群的风险）都较低。第四，局部药物易于在门诊环境中使用，减少了住院治疗的需求。
作者的部分化合物具备适合局部给药的特性，包括高logP值和小分子量（低于400道尔顿）。基于靶点发现的特征，作者选择了三个DNM化合物——DNM0487、DNM0547和DNM0614，在兔子缺血性耳部创伤模型中进行了测试。在该模型中，每种化合物通过局部涂抹治疗14天，所有化合物都显著改善了创伤的愈合；第14天的定量微生物学分析显示，与对照组相比，细菌存活率减少了99%以上。
图 2
作者选择了DNM0547进行更深入的研究。在兔子缺血性耳部创伤模型中局部涂抹DNM0547（2%），在第21天时创口完全愈合，并有效清除了创口中的细菌（图2a, b）。莫匹罗星是当前最主要的局部抗生素，年销售额达3.1亿美元，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）有效，目前用于治疗脓疱疮、其他皮肤感染，并作为MRSA的去定植剂。作者希望确定DNM0547在治疗缺血性创伤感染时是否具有优于这一主流局部抗生素的特性。事实上，莫匹罗星在临床上对糖尿病足溃疡（DFUs）无效，作者使用莫匹罗星验证兔子缺血性创伤模型能否模拟莫匹罗星无效的糖尿病足溃疡。结果表明，局部涂抹莫匹罗星（2%）对兔子缺血性耳部创伤模型的伤口愈合没有影响，与对照组无差异（图2c）。
此外，作者还在小鼠蜂窝织炎模型中进行了体内研究，以进一步验证DNM0547治疗感染的能力。蜂窝织炎是发生在真皮和皮下组织的感染。实验中，小鼠被皮内感染MRSA一天，然后使用含有DNM0547（2%）的乳膏或对照物涂抹治疗7天。结果表明，DNM0547使创口大小缩小了4倍，细菌负载减少了98%以上（图2d, e）。
DNM0547的抗菌作用范围
为了进一步确定DNM0547在治疗广谱革兰氏阳性多重耐药感染中的效用，作者测定了102株ATCC菌株和金黄色葡萄球菌、链霉菌和肠球菌的临床分离株的最低抑菌浓度（MIC），并将DNM0547与莫匹罗星、万古霉素、环丙沙星和红霉素进行了比较。DNM0547在除7株菌株外的所有菌株中均表现出MIC ≤ 2 μg/mL的效果，而万古霉素为37株，莫匹罗星为26株，环丙沙星为64株，红霉素为76株。在对DNM0547 MIC值 ≥ 2 μg/mL的7株菌株中，4株的MIC为4 μg/mL，2株为8 μg/mL，1株为32 μg/mL。结果表明，DNM0547可以有效治疗临床相关的耐药菌株。
此外，作者还希望确定DNM0547是抑菌剂还是杀菌剂。通过对两种不同的MRSA菌株进行时间杀灭实验，使用不同剂量的DNM0547测试。实验结果显示，使用4倍和8倍MIC浓度的DNM0547，在2小时内存活的细菌数量下降了三个对数单位，而2倍MIC浓度的DNM0547在2小时和6小时内也有类似效果。
编译|黄海涛
审稿|王梓旭
参考资料
Barden, C. J., Wu, F., Fernandez-Murray, J. P., Lu, E., Sun, S., Taylor, M. M., ... & McMaster, C. R. (2024). Computer-aided drug design to generate a unique antibiotic family. Nature Communications, 15(1), 8317.
