今天为大家介绍的是来自中国药科大学张晓进教授团队在Angewandte上发表的一篇论文，该论文将荧光偏振与原位抑制剂合成结合起来，提出一个原位抑制剂合成与筛选（ISISS）的策略,将高通量合成与高通量筛选集成为一体，极大提高发现先导化合物的效率。靶向动态组合化学融合了化合物合成与活性筛选两个步骤，已成为识别命中化合物的有用工具，由于其中复杂混合物的分析合成存在挑战，所以尚未得到广泛应用。
为此本文中作者做了一种操作简单的替代方案：原位抑制剂合成和筛选（ISISS），它将生物正交合成（组合化学）与荧光偏振筛选技术联系起来， 展示了如何通过荧光偏振技术将酰肼和醛的通过组合方式得到的苗头化合物进行活性筛选，从而有效地发现了一种有效的新型基于酰腙的人脯氨酰羟化酶 2 (PHD2) 抑制剂17，该化合物与批准临床的药物罗沙司他具有同等的体内活性。
药物化学的根本任务是设计和发现新药，药物设计的目的是寻找具有高效低毒的新化学实体。药物设计可大致分为两个阶段，即先导化合物的发现和先导化合物的优化。药物先导物的发现往往是药物早期研发的限速步骤之一，经典的先导物发现须经历“设计－合成－分离纯化－靶标活性评价”的循环优化的过程，研究周期较长。因此高通量药物筛选（HTS）成为大多数药企获得先导化合物的一种方式，它通过构建筛选方法去利用现有化合物库进行苗头化合物的发现，大大减少了获得先导化合物的时间。
传统的高通量筛选需要投入大量研发成本，一般需要筛选几十万个化学实体才有可能获得几个先导化合物，并且其依赖于自动化体系，其中产生的大量假阳性问题也使得筛选结果的准确性降低。组合化学是一种高效、快速合成大量不同化合物的方法。它的核心在于通过并行合成策略，创建化合物库，以供后续的生物活性筛选使用。因此组合化学与高通量筛选的结合为先导化合物的发现提供了一个强大的工具。组合化学生成的大量化合物库可以直接用于HTS，HTS 后通过数据可快速识别出具有活性的化合物，并且可根据靶点结构设计组合库，大大提高化合物命中率，也可通过HTS的结果指导组合库的结构变化，提高了研发效率，从而降低了研发成本。本文中作者提出了ISISS的方法，就是将高通量筛选与组合化学结合起来，加快了发现先导化合物步伐。
荧光偏振原理是基于荧光分子在受到偏振光激发时的行为。当荧光分子在激发时保持静止，发射光将保持与激发光相同的偏振性；如果分子在激发时旋转或翻转，发射光的偏振平面将不同于激发光平面，这种现象称为去偏振化。荧光偏振技术通过检测荧光偏振光强度的变化，可以用来研究分子间的相互作用，如药物与受体的结合等。荧光偏振光强度与分子的转动速度成反比，因此，小分子物质在溶液中旋转速度快，导致发射光的偏振程度较低；大分子物质在溶液中旋转速度较慢，导致发射光的偏振程度较高（图1）。这种特性使得荧光偏振技术非常适合用于高通量的药物筛选和环境监测等领域。
组合化学是指利用化学合成技术，系统地创建大量不同化合物的库，并对其进行生物学评价的科学方法（图2）。这种方法的核心在于并行合成和高通量筛选，以发现具有生物活性的化合物。组合化学库的设计基于不同的化学构建模块，通过这些模块的不同组合，可以合成出大量结构多样性的化合物。例如，通过改变构建模块的类型、数量和连接方式，可以创造出包含数百万种不同化合物的库。
方法构建框架：首先将片段A与片段B与蛋白一起加入到384孔板的单孔中孵育，然后加入荧光探针，最后通过监测荧光强度 (mP) 值的变化推测其生物活性高低（图3）。图3.原位抑制剂合成和筛选 (ISISS) 的原理和程序概述。mP：偏振值
在这个过程中需要解决下面两个影响因素，才能证明ISISS方法构建成功。作者在文中都做出了一一解答。脯氨酸羟化酶(PHD)2是非血红素铁(Ⅱ)依赖的酶，在氧气、铁以及α-酮戊二酸的存在下，可实现对HIF-a的羟基化.因此可以认为该蛋白存在2个底物口袋，通过对接，片段A（酰肼结构）可占据共底物（α-酮戊二酸）结合位点（口袋1），而片段B（醛）可占据底物（缺氧诱导因子-α，HIF-α）结合位点（口袋2）。基于靶标结构特征，以“酰肼+醛→酰腙”的生物正交反应为基础，利用酰肼片段A（5个）和醛片段B（102个，为商业化起始原料），形成酰腙获得有效的PHD2抑制剂（图4）。图4.原位合成/筛选的化合物在 PHD2（PDB ID：4KBZ）活性位点的对接结合模式。
荧光偏振实验表明，1 μM片段A与3 μM 的片段B 对PHD2蛋白都没有结合，因此对结果并不会产生影响。
进行核磁氢谱实验以实时监测酰腙的形成以及产物的稳定性/其形成的可逆性（图5 B）。FP 测定显示与 4-甲氧基苯胺具有良好的相容性，其存在大大提高了酰腙交换的效率。然后，通过在含有 PHD2 的 FP 缓冲液中使酰肼 (A1–A5) 和醛 (B1–B90) 与 4-甲氧基苯胺反应（图5 A），在 384 孔板中进行 ISISS。酰肼和醛组分混合后加入FP探针（6 h）；当使用酶标仪观察到偏振值（mP）稳定时记录 FP 信号。图表5.A)基于 PHD2 结构特征的 ISISS 验证，包括底物结合模式(PDB ID: 5 L9B) B)对 A3（50 mM）和 B82（150 mM）在 FP 缓冲液（50 μL D2O 和 450 μL DMSO-d6）中的反应进行实时氢谱分析。
通过FP确定需要合成纯化的组合物，在热图中显示红色的组合作为初步合成的苗头化合物（图6）。
图6.ISISS 的热图，酰肼 A (1 μM) 和醛 B (3 μM)。
考虑到化合物 1-10 的结构多样性和效力，选择化合物 1-10 进行合成验证。通过 FP 测定评估纯化的 1-10 对 PHD2 的亲和力（图7）；结果显示出与ISIS相似的趋势。与 Roxadustat (Ki =0.073±0.010 μM) 相比，最有效的化合物 2 (A2B74，Ki =0.068±0.006 μM) 和 3 (A3B74，Ki =0.048±0.004 μM) 表现出相当的 PHD2 结合亲和力。2和3的分子对接表明片段A的氮原子可以与以下物质形成5元螯合环活性位点二价铁 (图 7)。在该对接中，嘧啶环的羰基与Arg252形成氢键，而酰腙的氧与Tyr310形成氢键。值得注意的是，酚羟基的位置分别与 Val241 和 Ser242 形成氢键。
二羟基/儿茶酚片段已被确定具有引起毒性的潜力。因此，基于2和3的结合模式，使用具有卤素、羧基和其他基团的成分进行了进一步的ISISS研究，旨在取代二羟基部分，从而提高输出化合物的成药性 。筛选结果的散点图如图8A所示。鉴定出紧密结合的酰腙衍生物 (11–18)；其中大多数对 PHD2 表现出纳摩尔水平的亲和力。值得注意的是，化合物17（16 的异构体）仅在苯基羟基和苯基氯基团的位置上有所不同，显示出更有效的 PHD2 抑制作用，表观 Ki 值为 0.027±0.002 μM，而 16 的表观 Ki 值为 0.394±0.017 μM（图 8B）。图 8C 中 17与PHD2活性位点的对接意味着17的邻氯基团可以与Ser242形成氢键，而间羟基可以与Val241形成氢键。图8.A) ISISS PHD2 结合物抑制的散点图。B) 酰腙支架 (11–18) 及其与 PHD2 的结合亲和力。C) 17 与 PHD2 的结合模式（基于 PDB ID：4KBZ）
先导17 是一种有效的 PHD2 抑制剂，在顺铂诱导的小鼠模型中表现出抗贫血活性，并具有出色的体内安全性（图9）。
研究的创新性：（1）在于将动态组合化学和荧光偏振技术相结合，实现了高效的药物发现过程。通过原位合成，可以在384孔板中直接检测合成化合物的活性，并且一次可以进行大量化合物的活性验证，对哪些具有良好活性的化合物再进行合成与生物活性测试工作，避免了繁琐的步骤，加快了苗头化合物的发现与验证。（2）对于不熟悉合成工作的科研工作者提供了一种新的发现先导化合物的方式，无需合成表征工作，也可以粗略验证化合物活性。 研究的不足之处：（1）本研究的不足之处是只针对PHD2这一特定靶点进行了研究，对其他靶点的适用性还需要进一步验证。（2）研究中对合成产物进行了质谱和光谱表征，但只有进入下一阶段的化合物才需要进行这些表征，这可能会导致一些有潜力的化合物被忽略。（3）对于片段A选择5种特定结构化合物的理由并没有交代清晰。
(1) Li, Z.; Wu, Y.; Zhen, S.; Su, K.; Zhang, L.; Yang, F.; McDonough, M. A.; Schofield, C. J.; Zhang, X. In Situ Inhibitor Synthesis and Screening by Fluorescence Polarization: An Efficient Approach for Accelerating Drug Discovery. Angewandte Chemie International Edition 2022, 61 (45), e202211510. DOI: https://doi.org/10.1002/anie.202211510.
投稿人：魏 闯
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