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今天为大家介绍的是来自Tea Pavkov-Keller团队的一篇论文。自然界的对称性往往源于自组装过程，且具有多种功能。细胞表面层（S层）在许多细菌和古菌细胞中形成对称的晶格，发挥着促进细胞黏附、逃避免疫系统以及抵抗环境压力等重要作用。然而，由于S层的自组装特性和高度的序列多样性，其结构的实验表征具有挑战性。本研究介绍了SymProFold，该框架利用AlphaFold-Multimer的高精度预测，从蛋白质序列中推导出对称的组装体，重点关注二维S层阵列和球形病毒衣壳。该流程测试了这些系统中已知的所有对称操作（p1、p2、p3、p4和p6），并识别出最可能的组装对称性。预测的结构通过现有的细胞水平实验数据进行验证，此外使用了额外的晶体结构以确认多个SymProFold组装体的对称性和界面。总体而言，SymProFold框架能够准确预测与关键功能相关的对称蛋白质组装体，从而为在纳米技术、生物技术、医学、材料和环境科学等多个领域的应用提供了可能性。
对称性模式是从微观到宏观尺度普遍存在的基本特征。在分子层面上，对称性的驱动力是自组装，即个体组分通过相互作用自主组织成更大的有序结构。许多蛋白质具有对称结构，这对于它们的功能至关重要。
表面层（S层）是覆盖许多真细菌和古细菌菌株细胞包膜的二维多孔晶体蛋白阵列。S层由一个或多个（糖）蛋白亚基构成，这些S层蛋白（SLPs）通过熵驱动的过程自组装成高度灵活且动态的晶格，能够根据环境条件的变化进行结构适应。目前已知，S层具备多种功能，包括维持细胞稳定性、促进细胞黏附、充当分子筛并帮助适应渗透压应激。然而，每个S层的确切功能和组装特性仍不完全清楚。此外，S层为生成复杂的超分子组装体提供了独特的结构基础，具有广泛的应用潜力，特别是在纳米生物技术、生物仿生学、生物医学和合成生物学等领域。
传统的结构解析方法由于S层的超分子组装特性，通常难以获得完整组装的S层的原子分辨率结构。确定完整组装的S层结构仍然是一个挑战，目前仅有少数物种的S层实现了原子级别的解析。随着RoseTTAFold、AlphaFold2和AlphaFold-Multimer等结构预测程序的发展与精度的快速提升，这些工具正在弥补实验结构缺失与蛋白质相互作用之间的差距。在此，作者提出了SymProFold框架，该框架能够在不依赖对称性或寡聚状态等先验知识的情况下，仅凭序列信息作为输入，预测具有特定对称性和晶胞参数的完整组装蛋白质，相较其他方法更具优势。
模型部分
图 1
SymProFold的核心理念是结合S层中观察到的自然对称模式和寡聚体预测，以生成完整组装层的模型。整体工作流程概览如图1所示。
SymProFold使用fasta格式的序列文件作为输入，并通过AlphaFold-Multimer进行同源二聚体预测以检查其可预测性。同源二聚体的预测根据ipTM+pTM评分进行打分，评分的计算方法为ipTM得分的80%和pTM得分的20%。
接下来，需要在fasta文件中定义蛋白质的结构域，各结构域之间用换行符分隔。结构域边界可以手动设置，也可以使用自动化识别工具。两种方法都从使用AlphaFold预测全长蛋白质单体结构开始。在一个迭代过程中，小的结构域子部分会被合并，直到它们描述完整的结构域。初始的结构域子部分是通过局部次级结构的交联形成的链范围。通过分析接触面积、表面积及子部分序列长度之间的关系，相邻的结构域子部分会不断合并为更大的结构域子部分。当合并达到饱和状态时，迭代过程结束。在后处理步骤中，会为各结构域之间的连接区找到一个裁剪点，以最小化两个结构域之间的接触。在fasta文件中定义好结构域后，将生成一组五种不同的蛋白质子链，具体包括：全长序列、去除N端的子链、去除C端的子链、包含结构域前三分之一的子链，以及包含结构域后三分之一的子链。
对于每个子链，算法会启动不同的寡聚体预测（包括二聚体、三聚体、四聚体和六聚体）。每种预测会计算五个模型，并对生成的对称复合物进行评估和进一步处理。所有预测都要评估是否存在一个旋转对称轴，可以将寡聚体预测中的所有子链组分相互对齐，从而满足对称性要求。因此，算法会检查单体之间的夹角是否符合2、3、4或6倍旋转对称性，并且相关的旋转对称轴是否在允许的误差范围内（每个单体最大偏差5 Å）。具有ipTM+pTM评分≥0.20且单体之间存在界面的模型被视为对称复合物。每个复合物的旋转对称轴的阶数（k重）是根据其对称角度（2、3、4或6倍旋转对称轴）推导出来的。例如，某个SLP的子链的三聚体预测可能形成一个p6 S层，其旋转对称轴可以是3倍轴（Δφ = 120°）或6倍轴（Δφ = 60°）。在后者的情况下，6倍对称轴的特性由3个预测亚基来描述，而不是6个。
将来自两个不同聚类（对称轴）的对称复合物对进行测试，评估它们是否可能通过重叠区域的叠加形成重复的二维组装。至少一个结构域必须构成重叠区域。要测试的对称复合物对根据聚类中得分最高的指标选择。如果没有明确结果，可以测试来自不同聚类且ipTM+pTM评分较低的更多对称复合物对。对于一对对称复合物（A，B），首先将旋转对称阶数较高的对称复合物（A）在z方向对齐，然后通过重叠叠加补充相应数量的另一个复合物（B）的副本。对称复合物通过ChimeraX的matchmaker方法进行叠加。随后，将对称复合物B的旋转对称轴使用A和B之间的连接区作为支点对齐至z方向。接着，通过重叠叠加，用A的副本补充B，并对齐旋转对称轴。
组装好的S层叠加后，通过每个残基的平均分子间碰撞数和组装的弯曲评分进行评分。组装弯曲性通过对称复合物A和B的旋转对称轴之间的轴向倾斜来评估。弯曲评分是中心对称复合物A的轴与最近邻的对称复合物B的轴之间角度的均方根偏差（RMSD）。该评分经过标准化处理，使得0弧度（0°）的角度对应弯曲评分为0，π/2弧度（90°）的角度对应弯曲评分为1。将每个残基的平均碰撞数（公式(1)）与弯曲评分（公式(2)）相加，得到组合质量评分（公式(3)）。
使用确定的晶胞参数创建一个精确的晶胞。为了获得最佳模型，可以通过调整对称复合物对来优化质量评分。最终输出为一个mmcif文件，其中包含原始晶胞、晶胞参数和用于生成对称配对的对称操作，从而得到完整组装的S层。
公式1、2、3
使用实验数据对模型进行评估
表 1
作者选取了来自革兰氏阳性菌（Gram-positive bacteria）、革兰氏阴性菌（Gram-negative bacteria）和古生菌的多种S层蛋白，并使用实验发表的数据验证计算的组装模型（表1）。SymProFold提取的组装模型的晶胞参数与文献值一致（表1）。若有实验显微数据可用，作者也将这些数据与模型进行了比较（图2）。
图 2
总体来看，作者的预测结果在结构域排列和组装方面与已发表的数据吻合，晶胞参数的平均差异为5%（表1）。SymProFold预测的S层组装模型揭示了实验研究中提供有限且不明确的详细结构信息。对于气单胞菌、萘假芽孢杆菌、深海嗜热菌、甲烷球菌、热球菌、还原硫热球菌和伏尔加杆菌的S层，目前尚无关于晶胞参数、结构或对称性的实验数据。然而，SymProFold对这些S层的预测显示出较高的输出评分，表明了这些S层可能的对称性和结构架构（图3）。
图 3
目前确认所提出组装体的原子级高分辨率实验数据非常稀少。基于作者对阿尔维绿芽孢杆菌和甲烷球菌的预测模型，作者设计了只包含形成四重轴或二重轴的结构域的构建体。作者成功获得了这两个构建体的晶体结构（PDB 9FS9; PDB 9FSA），并将其与预测模型进行了比较（图2G、H）。将晶体结构与SymProFold模型对齐后，发现高度相似，阿尔维绿芽孢杆菌的RMSD值为0.65 Å，甲烷球菌为1.38 Å，这进一步验证了作者的预测组装结果。最近，炭疽芽孢杆菌EA1和海洋氨氧化菌Nitrosopumilus maritimus的SLP高分辨率结构也公开了出来，而SymProFold框架预测的十分准确，高度一致。
编译 | 黄海涛
审稿 | 王梓旭
参考资料
Buhlheller, C., Sagmeister, T., Grininger, C., Gubensäk, N., Sleytr, U. B., Usón, I., & Pavkov-Keller, T. (2024). SymProFold: Structural prediction of symmetrical biological assemblies. Nature Communications, 15(1), 8152.
