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今天为大家介绍的是来自马萨诸塞理工学院的王潇团队的一篇论文。基于mRNA的蛋白质和疫苗疗法可以通过增加翻译能力获益。在此，作者报道了一种名为连接促使mRNA-寡核苷酸组装（LEGO）的方法来增强翻译。作者系统性地筛选了不同的化学拓扑结构，并发现一种分支mRNA帽子能够在不依赖内含核糖体进入位点（IRES）的情况下，有效地启动线性或环状mRNA的翻译。两种化学修饰——在帽子上的锁核酸（LNA）N7-甲基鸟苷修饰和在5′非翻译区（UTR）上的LNA+5×2′-O-甲基修饰——增强了RNA与真核翻译起始因子（eIF4E-eIF4G）的结合能力，并提高了体外RNA对去帽酶的稳定性。通过对双帽mRNA和带帽环状RNA的多维化学拓扑工程，作者在体内将mRNA蛋白质的产量提高了多达十倍，并在新冠病毒（SARS-CoV-2）疫苗的初免和加强针接种后分别实现了17倍和3.7倍的抗体产量提升。LEGO平台为设计超越经典线性和环状RNA的非天然RNA结构和拓扑结构，提供了新的可能性，适用于基础研究和治疗应用。
mRNA疫苗的快速发展推动了其作为体内可编程蛋白质表达平台的临床应用。然而，mRNA的短半衰期和较低的翻译能力限制了其在疫苗和免疫疗法之外的应用。通过延长mRNA寿命和提高其翻译效率，有望促进从疫苗到基因编辑和蛋白质替代疗法等领域的发展。mRNA翻译的启动步骤依赖于5′端N7-甲基鸟苷（m7G）帽子和真核翻译起始因子（eIFs）的相互作用。2′-O-甲基（2′OMe）和N6-甲基腺苷（m6A）修饰影响eIFs的结合及mRNA的稳定性。现有的mRNA合成方法主要依赖体外转录过程中的帽子模拟物，但这些方法难以扩展到5′UTR的前两个碱基以外。
环状RNA（circRNA）由于对外切酶的抗性，具有更长的半衰期，但其翻译启动效率较低，依赖于IRES。这种翻译效率远低于当前疫苗中使用的帽子依赖机制。因此，针对circRNA的拓扑工程具有提升其稳定性和翻译能力的潜力。为此，作者提出了一种名为“LEGO”的模块化化学酶促合成策略，能够对mRNA的5′端进行多种修饰，通过该方法大幅增强线性和环状mRNA的翻译能力。
帽状结构和5′UTR修饰的结构-活性关系
为了在可控且可编程的方式下扩展RNA帽状结构和5′UTR的修饰范围，作者将帽子合成过程与mRNA的合成过程分离开。首先使用固相合成制备了带有5′-磷酸化的寡核苷酸，并通过化学方法使用m7G二磷酸咪唑化物（m7GDP-Im）及其衍生物进行修饰。作者发现，将寡核苷酸的对离子更换为铵离子，可以在不添加二价离子的情况下实现稳定的帽状修饰。此外，微调反相高效液相色谱（RP-HPLC）中的梯度条件，结合相对疏水的己基铵离子，使得作者可以大规模地分离出完全带帽状的产物。随后，这些带帽状的寡核苷酸被连接到5′-单磷酸化的mRNA上，实现了IVT生成的N1-甲基假尿苷（m1Ψ）100%替换，并通过RNA 5′焦磷酸水解酶（RppH）处理。
图 1
LNA、2′OMe和2′MOE显著提高了mRNA的翻译效率，而2′FA则抑制了翻译，手性反转的dA则几乎没有影响。为了评估帽子的修饰效果，作者合成了多种已报道可增强翻译的m7GDP-Im衍生物。LNA帽子模拟物（LNAm7G）成功地在24小时内将翻译效率提高了4.5倍。值得注意的是，LNAm7G帽子通过共IVT帽子修饰效果较差，但通过化学帽子修饰则非常有效，因为它不依赖于RNA聚合酶。
最后，作者结合了四种不同类别的最佳修饰，展示了它们的组合效果。有趣的是，将m6A与2′OMe或LNA糖骨架结合并未进一步增强翻译效果。而同时引入LNAm7G帽子和在+1位引入LNA，或在+1到+6位引入2′OMe，分别将翻译效率提高了8.6倍和7.5倍。
双帽mRNA的化学拓扑优化
除了直接编码在寡核苷酸中的化学修饰之外，作者假设在mRNA的5′端引入多个帽子可以通过增加eIF结合的价键数来提高翻译效率。现有的关于帽子依赖的翻译启动机制表明，eIF4E与m7G帽子的结合会通过蛋白质-蛋白质相互作用招募其他eIFs（图2a）。鉴于m7G帽子作为锚点引导翻译起始复合物（TIC）的形成是基于位置接近的方式进行的，作者推测，帽子与mRNA其余部分之间的连续磷酸二酯骨架可能不是必需的。因此，向单个mRNA转录本的5′UTR中添加额外的帽子可能通过增强RNA与TIC的相互作用来提升翻译效率（图2b）。因此，作者进一步引入了点击化学基团来实现mRNA转录本的拓扑工程。
图 2
受到初步结果的鼓舞，作者使用类似的工作流程合成了双帽寡核苷酸，通过铜催化的叠氮基-炔基环加成反应（CuAAC）将化学帽子修饰的叠氮基标记或炔基标记的寡核苷酸连接起来，随后进行HPLC纯化（图2c, d）并与FLuc mRNA连接。作者发现，仅通过内部分支帽子也可以有效启动mRNA翻译，尽管效率不如天然拓扑结构中的5′端帽子（图2e）。这部分可能是由于分支帽子无法防止mRNA的5′到3′降解，正如在转染后8到24小时内发光量快速下降所表明的那样（图2f）。
接下来，作者对分支位置（从5′末端到分支点的距离）和带帽寡核苷酸分支的长度进行了二维筛选。在+2位之后添加额外的带帽分支则有助于提高翻译效率，分支长度为5–15个核苷酸的带帽寡核苷酸表现出了最佳的翻译效果（图2g, h）。作者将帽子、5′UTR和3′poly(A)尾部的化学修饰和拓扑结构集成到一个mRNA转录本中，并发现最佳组合（双LNAm7G帽子，LNA + 5×OMe_6×PS/2MOE_ddC）使得蛋白质表达在8到72小时内比传统的仅含m7G-rG帽子和m1Ψ的线性mRNA提高了5.5到96倍（图2i）。
5′端修饰增强了eIF的亲和力及对hDcp2的抗性
为了无偏地表征识别合成5′修饰的蛋白质结合物，作者使用SILAC（细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记）进行了免疫沉淀分析。将HEK293T细胞的细胞质裂解物与涂有20个核苷酸长度的5′带帽或3′生物素化寡核苷酸的磁性链霉亲和素珠子一起孵育，目的是捕获识别帽子附近修饰的RNA结合蛋白（RBPs）。这些合成寡核苷酸底物包含一个经典的单m7G-rG帽子或一个优化的5′端化学修饰组合，通过同位素比率定量质谱（qMS）测量修饰特异性蛋白质的富集（图3a）。
图 3
令人满意的是，与单m7G-rG寡核苷酸相比，优化后的5′修饰显著富集了参与eIF4–eIF3依赖翻译起始途径的主要蛋白质，包括eIF4E1（富集15.2倍）、eIF4G1（42.1倍）、eIF4G3（27.9倍）、eIF3A（5.8倍）和eIF4A1（2.5倍），而eIF2B则减少了（-5.1倍），这可能与寡核苷酸的长度及其在翻译起始过程中下游位置有关（图3b）。通过Ingenuity通路分析（IPA）对优化5′修饰组的富集蛋白质进行预测，表明eIF复合物通过5′RNA修饰的稳定结合总体上促进了翻译起始，支持了作者在实验中观察到的修饰RNA翻译效率的提高（图3c）。
因此，作者进一步研究了部分帽子和5′UTR修饰对eIF4E结合的影响。使用荧光标记的带帽寡核苷酸，通过电泳迁移率变动分析（EMSA）定量其与eIF4E的亲和力（图3d）。尽管Kd的下降幅度看起来适中，但考虑到细胞质中的eIF4E浓度是有限的，亲和力的提高可能会导致在生理条件下eIF4E的占用率提高2.7–5.5倍。作者还发现，eIF4G的富集程度（45.2倍）显著高于eIF4E，这促使作者进一步推测，优化的修饰可能使eIF4E结合的构象增强了eIF4G的招募，从而形成RNA-eIF4E-eIF4G三元复合物。
双帽结构通过eIF4E增强了翻译效率
为了深入了解拓扑分支的内部帽子如何启动mRNA翻译，作者通过EMSA（电泳迁移率变动分析）测量了它们与eIF4E的亲和力。结果表明，双帽寡核苷酸显著增强了eIF4E的亲和力，将解离常数（Kd）从2214 ± 139 nM降低至1414 ± 135 nM。
接下来，作者进行了原位RNA分析，以确认双帽结构确实增强了mRNA的翻译效率。通过配对的STARmap和RIBOmap技术，分别在单细胞水平上检测了总mRNA和核糖体结合的mRNA。通过两者的比率估算翻译效率（图3f, g）。这些原位分析技术还允许过滤大量被困在内体中的非翻译性mRNA，从而更准确地捕捉到细胞质中正在翻译的mRNA状态。正如预期的那样，虽然两种构建体的总mRNA水平相似，但在整个细胞群体中，双帽mRNA的核糖体结合mRNA水平显著更高，翻译效率提高了约1.8倍（图3h–j）。最终，作者得出结论：双帽mRNA的翻译能力主要通过增强eIF4E的经典帽子结合活动而提高，并不涉及eIF3D的特定帽子结合活动。
合成含m1ψ的带帽环状RNA
由于分支帽结构能增强线性mRNA的翻译，作者推测它们也可以同样刺激环状RNA（circRNA）上的内部开放阅读框（ORF）的翻译。如图4a所示，尽管环状RNA具有较强的外切酶抗性，但缺乏线性mRNA的5′帽子和poly(A)尾结构，因此需要依赖IRES（内含核糖体进入位点）进行翻译启动。然而，通过IRES的启动速度通常比经典的帽子依赖机制要慢。
图 4
在图4b, c中，由于分支帽结构不依赖裸露的RNA末端，作者推测将这种结构引入到circRNA中以替代IRES，可能同时保持其高稳定性并利用更有效的帽子依赖翻译启动机制。作者将这种带帽的环状mRNA称为QRNA，因为它的结构与字母“Q”相似。合成含m1ψ的QRNA面临两大挑战：（1）通过点击化学反应引入分支帽子；（2）在不依赖内含子反向剪接的情况下实现RNA环化。
为了验证QRNA翻译的可行性，作者首先通过在3′UTR中引入一个叠氮化修饰的胞嘧啶，合成了编码HiBiT肽的最小RNA。然后，通过T4 RNA连接酶1利用5′和3′UTR中的同源区将该最小mRNA环化，生成了叠氮标记的环状RNA。接下来，通过点击反应将一个5′ m7G帽子和3′ OU标记的寡核苷酸连接到叠氮化的环状RNA上，生成最小的QRNA。
为了解决无需内含子反向剪接实现RNA环化的挑战，并在QRNA中引入m1ψ修饰，作者采用了改进的LEGO程序，对circRNA进行特定位点的化学和拓扑工程。通过T4 RNA连接酶I和RtcB连接酶，将化学合成的5′磷酸化或3′磷酸化寡核苷酸与IVT生成的5′羟基或3′羟基mRNA串联连接，并利用5′或3′UTR编码的同源序列促进环化。QRNA产物随后通过RP-HPLC纯化，并通过双RNase H实验确认其环化。
作者合成了一组NLuc QRNA，带有各种修饰的帽子，并与之前报道的修饰（如在5′UTR中引入特定位点的m6A或PS修饰的circRNA）进行了对比。两种m1ψ修饰的QRNA结构显著优于通过内含子反向剪接和RNase R处理产生的含人类鼻病毒（HRV）IRES的未修饰环状RNA。这些结果表明，尽管QRNA内部带有非天然化学连接，但其潜力足以作为补充或替代IRES的治疗性RNA工具。
翻译启动的“帽子近端”机制
如图4e, f所示，当内部帽子通过分支拓扑结构共价结合时，能够通过依赖eIF4E的机制在线性或环状mRNA上启动翻译。这一发现为当前翻译起始模型提供了新见解。为了实验性探究分支帽诱导的核糖体插入机制，作者设计了一个FLuc报告基因，探测分支帽插入后核糖体的落位位置。当将分支帽放置在F-AUG上游40个核苷酸时，其翻译水平与经典的m7G帽子相似，但当放置在30个核苷酸上游时，翻译水平显著下降，表明40S可能选择了下游的框外起始密码子。将分支帽放置在20个核苷酸上游时，翻译部分恢复，但效率低于40个核苷酸上游的分支帽。作者推测，恢复的翻译可能是由于40S在分支位点上游的“后插入”。
接下来，作者考察了是否可以将天然的5′帽子和3′ poly(A)特征拓扑翻转为合成的3′帽子和5′ poly(A) mRNA，并通过UTR编码的同源性诱导翻译。令人满意的是，3′帽子和5′ poly(A)设计的NLuc mRNA表达水平比未带帽的对照提高了29倍。将3′帽子从m7G-rG修饰为LNAm7G-LNA + 5×OMe进一步使表达提高37倍。最后，作者生成了一个包含5′全长FLuc ORF和3′ 3× HiBiT ORF的双ORF报告mRNA。与未带帽的QRNA对照相比，QRNA在FLuc ORF和HiBiT ORF的表达均显著提高。这些结果表明，分支帽可以通过直接近端或反向扫描驱动上游ORF的翻译。
双帽mRNA和QRNA在体内的增强表达
受到细胞内实验结果的鼓舞，作者进一步评估了双帽mRNA和QRNA在体内的表现。通过LEGO合成了编码NLuc的双帽mRNA，结合了最有效的翻译增强基序，并与单m7G-rG帽进行比较。小鼠在mRNA-脂质纳米颗粒（LNP）给药后的不同时间点进行了生物成像。单帽构建体的生物发光在6小时达到峰值，但在96小时迅速下降。而双帽mRNA的信号在24小时达到峰值，并在144小时保持高表达，注射后长达14天仍可检测到，表明其增强和持久的表达（图5a-c）。
图 5
接着，作者使用相同的NLuc基础测定评估了QRNA设计在体内的表现。m1ψ替代的LNAm7G帽子QRNA在8、24和48小时的翻译水平分别比未带帽的circRNA前体高出17倍、30倍和59倍。与传统的m1Ψ修饰线性mRNA相比，QRNA的翻译在24小时达到峰值，而传统线性mRNA在6小时达到峰值。尽管当前版本的QRNA在性能上不及优化的双帽mRNA，但仍然有潜力作为进一步工程的基础（图5d）。
随后，作者合成了编码人促红细胞生成素（hEPO）的单帽和双帽mRNA。hEPO是一种用于治疗贫血的分泌性肽激素。mRNA-LNP给药后，修改过的双帽组在注射后72小时内观察到了血浆hEPO的表达，且总hEPO产量比单帽对照组高7.7倍。在第6天，作者在另一个队列中评估了血浆网织红细胞计数，以评估治疗效果。优化的双帽mRNA使网织红细胞计数显著增加64%，而单m7G-rG帽mRNA在该剂量下的效果不显著。最后，作者通过测量血浆肿瘤坏死因子（TNF）和血浆丙氨酸氨基转移酶（ALT）来测试双帽mRNA的毒性。所有组别的生物标志物均未观察到显著变化，表明双帽改性mRNA适合用于治疗应用（图5e-g）。
双帽mRNA用于针对SARS-CoV-2的疫苗
除了在激素替代治疗中的应用外，作者还评估了双帽mRNA在SARS-CoV-2疫苗接种效果上的表现。作者使用优化的双-LNAm7G-LNA + 5×OMe-6×PS + 2MOE mRNA和单m7G-rG对照mRNA，编码SARS-CoV-2刺突糖蛋白的受体结合域（RBD）。采用常规的初免-加强两剂方案，结果显示，单帽对照mRNA在注射3周后产生的抗刺突IgG为221±122 µg/ml，而优化的双帽mRNA在初免后7天即产生可检测的IgG，并在14天和21天时分别比对照组高出17.1倍和3.7倍，表明其增强的抗原表达能力刺激了更强的特异性免疫应答。
图 6
为了获得关于优化的双帽mRNA疫苗有效性的免疫学见解，作者在加强注射后24小时提取了鼠的腹股沟淋巴结，并进行原位测序。与单帽和对照组相比，优化的双帽mRNA在B细胞区显著产生了更多活跃翻译的RBD转录本，所有抗原呈递细胞（APCs）均显示出9.6倍更高的RBD翻译。
随后，作者比较了免疫小鼠在第21天后的记忆CD4+和CD8+ T细胞介导的效应功能。用SARS-CoV-2 Spike RBD多肽刺激的脾细胞显示，优化的双帽mRNA诱导的CD8+ T细胞产生干扰素-γ（IFNγ）的比例增加了4.0倍，表明其诱发了更强的特异性CD8+ T细胞应答。同时，优化双帽mRNA也显著提高了产生IFNγ的CD4+ T细胞比例（4.2倍）。这些结果表明，优化的双帽mRNA疫苗诱导了显著增强的T辅助细胞免疫反应。
讨论
总之，作者通过串联化学帽子修饰和连接的工作流程（LEGO）系统地合成并表征了mRNA帽子、5′和3′非翻译区（UTR）及poly(A)尾的化学修饰，该方法克服了体外转录的限制，并能够高效地引入任意末端结构基序或修饰。作者的研究展示了用于优化mRNA功能和药代动力学的药物化学级精确度和多样化合成策略的示例和方法，而这在过去仅能应用于小分子和寡核苷酸药物发现。
编译 | 于洲
审稿 | 王梓旭
参考资料
Chen H, Liu D, Aditham A, et al. Chemical and topological design of multicapped mRNA and capped circular RNA to augment translation[J]. Nature Biotechnology, 2024: 1-16.
