近日，香港大学张彤教授团队在Environmental Science and Ecotechnology（IF=14）在线发表题为“High-throughput single-cell sequencing of activated sludge microbiome”的论文。该研究首次利用微生物单细胞基因组测序技术绘制了活性污泥样本中微生物和耐药基因的单细胞图谱，增强了我们对这一复杂样本微生物组中水平基因转移（HGT）的理解，特别是与耐药基因（ARGs）相关的HGT，为活性污泥生态系统提供了新的见解。
活性污泥（AS）作为污水处理厂广泛采用的生物处理方法，对保护环境和人类健康至关重要，其包含微生物种群丰富多样，了解它们的种类和作用是优化其处理效率的关键。污水处理厂是抗生素耐药基因交换的关键场所，基于“One Health”概念的提出，需要强调在污水处理厂开展ARG研究的必要性。高通量测序和宏基因组分析的发展有助于了解微生物群落，但仍面临细胞基因组异质性、微生物暗物质发现、无法准确地将ARGs和可移动遗传元件（MGEs，如质粒和噬菌体）与其特定的单个宿主细胞联系起来等挑战。单细胞测序能解决这些问题，提供单个细胞的遗传信息，推动抗生素耐药性发生、MGE-宿主关系等课题研究发展。多种技术促进了单细胞测序发展，如分选平台和微流控平台整合应用，但尚未有研究对活性污泥样品进行高通量单细胞基因组测序分析。
该研究获得了350 GB的原始测序数据（1.1×109 reads），揭示了15,110个单细胞水平的single-amplified genomes (SAGs)和2,454个物种水平上的SAG bins，污染度比较低（平均0.8%）。研究发现了27.5%的物种水平SAG bins属于的新基因组。分析SAG bins多样性后发现1,918个（95.7%）细菌SAG bins和38个古菌SAG bins（0.4%）。细菌主要分布在变形菌门、拟杆菌门和蓝细菌门，相对丰度分别为25.6%、25.5%和12.8%。其中包括一些AS常见功能菌群，例如 3类氨氧化细菌g_Nitrosomonas和1类亚硝酸氧化细菌o_Nitrospiria。研究者还从中发现了一些新的固氮微生物类群，如Omnitrophota候选细菌门，这种细菌尚未被分离出来，也知之甚少。总体而言，基于液滴微流控的单细胞测序确保了少数细菌群体的测序、组装和注释，能够找到被宏基因组组装基因组(MAGs)忽视的一些低丰度微生物，比如3.5%丰度的21个细菌门仅在单细胞数据中存在，体现了单细胞基因组测序技术在具有挖掘低丰度群体和发现新分类菌群上的巨大潜力。
01
ARGs及其宿主的分析
在15,110个SAGs中检索到1,137个ARGs，相当于每个细胞约0.9个ARG 拷贝。之前的文献显示在WWTP的AS样本中每个细胞有0.3-0.7个ARGs拷贝。单细胞测序结果与之前结果的一致性证实了单细胞测序的准确度。在本次单细胞测序结果中，排名前四的ARGs种类分别是四环素、MLS、β-内酰胺和多药耐药类，它们主要在变形菌门(41.8%)、Patescibacteria菌门(14.2%)和厚壁菌门(11.0%)的细菌中检出。平均而言，32.8%的ARGs出现在质粒上。考虑到质粒的高传播性，在质粒中出现频率较高的ARGs对环境和人类有较高风险。此外，相同的AS样品也进行了宏基因组得到ARG谱图。结果显示宏基因组结果中的ARG拷贝数为每个细胞0.3个，与单细胞测序数据相比在耐药基因类别和丰度上有一些差异。总结而言，单细胞测序是揭示更多ARG-宿主菌关系的有力工具，而这些关系在宏基因组学极有可能无法被检测到。
02
质粒及其宿主的分析
该研究中在1,514 SAG bin中注释到10,450个质粒片段，平均长度5.5 kb，593个能够进行分类学注释，并被划分为41个菌门，其中数量最多的前三个门是变形菌门(193)、Patescibacteria菌门(82)和厚壁菌门_A (70)。进一步分析这些质粒在细菌中的关联关系，在有物种注释信息的273 SAG bins中找到了12,819个对应关系，这些结果充分证明了质粒作为环境中典型的MGEs和微生物中HGT的关键成分对抗菌素耐药性传播的关键作用，也体现了微生物单细胞基因组测序技术在还原质粒与细菌细胞归属关系以及解析细菌间潜在质粒转移现象的强大优势。
03
噬菌体及其宿主的分析
作者在617个SAG bins中获得了总共1,343个噬菌体contigs，包括563个细菌SAG bins、5个古菌SAG bins和49个未分类SAG bins。有尾噬菌体纲在Shatin wastewater treatment plants (ST WWTPs)中具有优势地位，只有7.9%的噬菌体能够在目水平上被注释，这表明AS系统的噬菌体挖掘潜力巨大，并且迫切需要扩大现有数据库多样性。
近年来，噬菌体引起的ARG传播被认为是导致新的多重耐药性菌株出现的重要机制。本研究中检测到五种噬菌体携带的ARGs，包括MLS (2)、四环素(1)、多药耐药(1)和氨基糖苷类(1)。作为一种典型的MGE，噬菌体在原核生物进化中起着重要的作用，该研究识别了可以感染不同宿主的噬菌体，并且鉴定了184组宿主-噬菌体关系，其中59组在宿主的不同分类水平上显示出保守性。一些噬菌体表现出广谱的宿主范围，例如，Patescibacteria菌门的噬菌体也可以侵染其他五个门的宿主，如变形菌门和拟杆菌门。微生物单细胞基因组测序技术精准还原单个细菌中包含的噬菌体信息，能够深入了解噬菌体对细菌的影响，尤其是具有多个宿主的噬菌体，对于WWTPs等环境中微生物群落的调控具有重要意义。
结合单细胞测序和宏基因组学的联合分析方法可以获得更好的基因组得率和更准确的微生物种群分辨率。2,454个SAG bins中有812个基因组的质量通过MAGs的整合辅助得到改善。一方面，基因组的平均完整度有所提高，使得中高质量的基因组数目增多；但另一方面，污染度增加导致一些完整度较高的基因组被判定为中质量基因组。因此，如何利用算法来提高基因组的完整性，并确保低污染水平，将是后续分析方法开发的关键技术问题。另有98个之前“未分类”的SAG bins成功被注释到20个细菌门。此外，联合分析增加了SAG bins中ARGs、质粒和噬菌体的宿主关系信息的获取：额外注释到了22个ARGs, 60个质粒片段和51个噬菌体片段。以上结果表明，MAG和SAG在完善基因组信息方面具有互补作用。SAG可以确定正确的组装结果，并提供更多MAG不同细胞间异质性的细节。这两种测序方法的结合可以从宏观和微观两个角度全面揭示微生物群落。作者也强调需要开发更加全面和适合的算法来整合两种组学的数据。
通过上述研究成果，我们可以看到了微生物单细胞基因组测序技术在基因组异质性挖掘、少数群体验证、宿主-MGE（可移动遗传元件）关系鉴定等方面具有显著优势。特别是针对抗生素抗性基因转移的探索，不仅更好地实现对污水处理过程中的耐药基因监测，也揭示了MobiMicrobe微生物单细胞基因组技术在环境领域的应用潜力。文章中使用的微生物单细胞基因组检测技术为墨卓生物的MobiMicrobe-seq，该技术曾于2022年发表于顶尖期刊Science杂志，是一款能够基于液滴法实现复杂微生物样本超高通量微生物单细胞基因组测序的技术平台。基于自主研发的液滴微流控仪器和配套试剂，在液滴生成、融合等过程中实现复杂样本中单个细菌细胞的包裹、裂解、全基因组扩增、片段化、加标签等精微实验，助力客户深入细胞和菌株水平研究，溯源质粒、噬菌体等可移动遗传元件介导的水平基因转移事件，解析微生物间密切的相互作用关系。这对于在“同一个健康”方法下保护公共卫生至关重要。除了对改进监测和选择策略铺平道路外，本研究也证实了，单细胞测序和宏基因组的联合分析有助于提升微生物群落信息的完整性和准确性。相信随着该技术平台在样本预处理、生信算法开发等方面的逐渐优化完善，能够更好地绘制不同微生物组的图谱、探究不同条件下微生物种群的动态变化及其对干扰的响应，助力微生物组学研究的全新未来！
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