AAV（腺相关病毒）因其免疫原性低、安全性高、宿主范围广、组织特异性、长期稳定表达等特点，已被广泛的应用在动物水平的基因表达、基因操作和基因治疗。全球肾病患者规模庞大，选择AAV治疗是因其能够精准靶向肾脏细胞，减少对其他器官的影响。
AAV在肾脏组织的靶向策略需要综合考虑血清型选择、启动子使用和注射方式等多个因素，以优化基因治疗的效率和特异性。
接下来，让我们一起学习一下
肾脏是人体的重要器官，具有清除体内代谢产物及某些废物、毒物，调节水、电解质平衡及维护酸碱平衡、内分泌功能等功能，保证了机体内环境的稳定，使新陈代谢得以正常进行。肾脏疾病是全球性的公共卫生问题。据悉，全球有约8.5亿人患有肾脏疾病，而中国慢性肾脏病患者已超过1个亿。
图1. 人体肾脏解剖图（来源：千库网）
肾脏结构复杂、细胞种类多样。通过众多研究人员[1]的努力，绘制出了最全面的人类肾脏组织图谱（图2）。这个肾脏组织图谱包括51种主要肾脏细胞类型，主要细胞类型为以下几种：
1. 肾小球内皮细胞：构成肾小球毛细血管壁的一部分，参与滤过过程。
2. 足细胞（脏层上细胞）：位于肾小球基底膜的一侧，与内皮细胞和基底膜共同构成滤过屏障。
3. 肾小管上皮细胞：根据肾小管的不同部位，上皮细胞具有不同的形态和功能，参与重吸收和分泌过程。
4. 集合管细胞：负责进一步调节尿液的组成。
5. 间质细胞：包括成纤维细胞、平滑肌细胞等，构成肾脏的支持结构。
6. 肾小球旁器细胞：参与肾素的分泌，参与调节血压。
图2. 肾脏组织图谱[1]
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研究人员通过不同的给药方式验证了多种血清型对肾脏的侵染能力，结果表明AAV9血清型对于肾脏侵染能力最强。
Chung D C等人[2]，采用输尿管逆行注射的注射方式对比rAAV1，rAAV2，rAAV5，rAAV6，AAV6.1.2，AAV.rh8，rAAV7，rAAV8和rAAV9对于小鼠肾脏的侵染效率，发现rAAV8和rAAV9能够有效地感染小鼠肾小管细胞（图3）。
图3. 不同血清型对肾小管的侵染[2]
在另一项研究中， Rocca C J 等人[3]通过肾静脉注射，对比了rAAV5，rAAV6，rAAV8和rAAV9在小鼠肾脏中的表达情况。实验结果表明rAAV6和rAAV8通过肾静脉注射能够转染肾脏，但主要局限于肾髓质区域，而rAAV9则能够高效转染肾皮质和髓质两个区域（图4）。共聚焦显微镜发现注射rAAV9 - GFP的肾脏中近端小管和肾小球呈GFP阳性，在肾小球中，足细胞和系膜细胞中均检测到GFP（图5）。
图4. 肾静脉注射不同血清型对肾脏和其他器官的侵染[3]
图5. AAV9侵染肾脏免疫荧光图片[3]
肾脏中细胞结构复杂，种类较多。在一些研究中，目的基因不需要特异性表达可以采用CMV启动子，也可以针对不同的肾脏细胞采用对应的特异性启动子获得最佳的感染效果。
Asico等人[4]使用输尿管给药的方式对比了CMV，KSPC，SGLT2，NKCC2和ECAD启动子，在小鼠肾脏中的特异性表达情况（图6）。结果表明：
CMV启动子：可以在近端小管(PT)和集合管(CD)细胞中提供强烈的GFP表达。
KSPC启动子：可以在整个肾小管（从近端小管到集合管)中提供基因表达。
SGLT2启动子：可以在近端小管细胞中提供表达，但不能在集合管细胞中表达。
NKCC2启动子：在近端小管和集合管细胞中的表达都很微弱。
ECAD启动子：仅在集合管细胞中提供表达，而不能在近端小管细胞中表达。
图6. 不同启动子在肾脏中的表达情况[4]
CLDN5在足细胞中的缺失导致WNT抑制剂WIF1的表达降低，从而激活了WNT信号通路。这种WNT信号失调导致了足细胞损伤、蛋白尿和小鼠糖尿病肾病和梗阻性肾病模型中的肾脏纤维化。研究人员使用NPHS1特异性启动子病毒通过肾原位注射，在足细胞中过表达了WIF1（图7），和对照AAV处理的突变小鼠相比，WIF1处理组的足细胞损失显著减少[5]。
图7. rAAV9-NPHS1-WIF1在肾脏表达情况[5]
ALDH2缺乏会加重肾损伤。为了抑制ALDH2基因在RTECs中的表达，Xu, Tonghui等人[6]通过尾静脉注射AAV9-Ksp-GFP-shALDH2病毒，发现CI-AKI小鼠表现出更严重的肾损伤和肾小管上皮细胞凋亡。研究发现，Ksp启动子心脏和肝脏中很少表达，在肾小管上皮细胞中大量表达（图8），说明Ksp启动子有较强的肾脏上皮细胞的特异性。
图8. AAV9-Ksp-GFP-shALDH2在肾脏表达情况[6]
选择合适的给药途径是基因治疗重要的因素。肾脏最常用的给药方式为肾脏实质注射、肾盂内注射和输尿管给药。
哺乳动物的肾脏有过滤功能，排斥大于50KD的蛋白质，此外，肾小球内的足细胞形成直径仅为10nm的狭缝横隔膜，传统的AAV载体全身给药难以在肾脏达到足够的表达水平。为了提高病毒载体对肾脏的转导，除了全身给药方式，研究人员陆续开发了多种肾脏局部给药方法。为此，小编汇总成了表1，并将其中常用的几种肾脏给药方法具体步骤列在下方，以供大家参考。
表1. AAV肾脏给药方式
注射方式 | 注射量 | 血清型 | 动物模型 |
尾静脉注射[6] | 5E+11~1E+12 vg | AAV9 | 小鼠 |
肾静脉注射[3, 8] | 5E+10~1E+12 vg | AAV9 | 小鼠 |
肾脏实质注射[3, 8] | 1E+11 vg | AAV9 | 小鼠 |
肾盂内注射[12] | 1E+11 vg | AAV9 | 小鼠 |
输尿管给药[2, 4] | 1E+11 vg | AAV9 | 小鼠 |
这一期和大家从血清型、特异性启动子和给药方法3个方面，分享了AAV在肾脏组织研究中的靶向策略。赛业生物提供大量靶向特异组织器官的高质量科研AAV包装服务，欢迎各位老师关注及咨询订购。
参考文献
