​心血管疾病流行病学|中国成年人血浆酰基肉碱和胆汁酸水平与冠心病发病风险的关联研究

冠心病（coronary heart disease，CHD）导致了沉重的疾病负担。近30年间，CHD始终是造成全球全因死亡的主要原因 ^［ 1 ］ 。2020年，我国城市居民中CHD死亡率为126.91/10万，农村为135.88/10万；全国CHD患者人数达1 139万 ^［ 2 ］ 。因此，亟须探索CHD的病因机制，探寻早期生物标志物，将关口前移，推动CHD的一级预防。

酰基肉碱是由脂肪酸和肉碱结合产生的酯类物质，主要参与细胞内的脂肪酸β氧化、产生能量，进而维持细胞活动 ^［ 3 ］ 。与肠道菌群密切相关的胆汁酸同样具有调节宿主脂质代谢、葡萄糖和胰岛素代谢、能量平衡和炎症反应等功能 ^［ 4 ］ 。研究表明，在肠道菌群失调时期，可观察到酰基肉碱水平的大幅改变，提示酰基肉碱与肠道菌群代谢相关 ^［ 5 ］ 。目前已有人群研究关注酰基肉碱和胆汁酸与包括CHD在内的心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）之间的关联，发现酰基肉碱与胆汁酸水平在健康人群和CVD患者中存在差异，且在肥胖和糖尿病患者中与未来CVD发病风险相关 ^{［ 6-13 ］} 。然而，既往研究以欧美人群中的横断面研究为主，多在具有基础疾病的患者中评价两类代谢物对CVD二级预防的作用。目前尚缺乏在我国一般人群中开展的相关研究。因此，本研究将利用中国慢性病前瞻性研究（China Kadoorie Biobank，CKB）中血浆代谢组学检测数据，探索酰基肉碱和胆汁酸与CHD发病风险之间的关联。

CKB项目的基线调查开展于2004—2008年，从全国5个城市和5个农村地区招募约51.3万名30~79岁成年人，调查项目包括问卷调查、体格检查、血标本采集。所有调查对象均签署知情同意书，研究已获得北京大学生物医学伦理委员会的批准（批号：IRB00001052-20040） ^［ 14 ］ 。

基线调查完成后，于2008年7—10月在10个项目地区开展第1次重复调查，以居委会或行政村为单位在各个项目地区采取整群随机抽样的方法抽取19 786名调查对象，调查项目与基线调查一致 ^［ 15 ］ 。随后，在参与重复调查的人群中，选择符合以下标准的调查对象进行血浆代谢组学检测：（1）第1次重复调查采血时，空腹时长≥8 h；（2）基线调查时被选中参与基因组检测并具有全基因组基因分型数据 ^［ 16 ］ ；（3）基线调查和第1次重复调查时自报未患心脑血管疾病、糖尿病或恶性肿瘤，未服用降压、降糖、降脂药或心脑血管疾病药物，且两次调查之间未新发CHD；（4）截至2017年12月31日未失访。根据以上标准筛选出研究对象2 159名，并于2021年6—12月完成检测。

1. 协变量信息：研究涉及的协变量信息均由统一培训的调查员或技术人员获得。通过面访式电子调查问卷，收集研究对象的一般人口学特征和生活方式信息，包括性别、年龄、城乡分布、文化程度、家庭年收入，吸烟、饮酒状况，体力活动水平，蔬菜、水果和红肉摄入频率。通过体格检查，收集研究对象的身高和体重等信息，计算体质指数（body mass index，BMI）。

2. CHD发病信息：研究对象的发病和死亡信息通过多种途径获取，包括当地死亡和常规疾病监测系统、全民医疗保险数据库和主动定向监测。此外，CKB项目开展了对包括CHD在内的多种慢性病新发事件的病例复核工作，由专业的心血管疾病专家检索、审查病例的相关病历记录，保障疾病监测的数据质量。发病或死因分类采用国际疾病分类（International Classification of Disease，ICD）第十版，即ICD-10。本研究关注的CHD所对应ICD-10编码为I20-I25。随访截止日期为2018年12月31日。

采集研究对象的10 ml血样，经离心、分装后在-80 ℃冰箱中长期保存。委托北京华大蛋白质研发中心有限公司对血浆样本进行代谢组检测，采用MxP ® Quant 500 Kit代谢组检测试剂盒（奥地利Biocrates Life Sciences AG公司），对40种酰基肉碱和14种胆汁酸的血浆浓度进行靶向质谱检测。酰基肉碱检测方法为流动注射分析/串联质谱，胆汁酸检测方法为液相色谱串联三重四极杆质谱。所检测代谢物的详细类别见 表1 。

采用R 4.1.3软件进行统计学分析，采用Benjamini-Hochberg法对 P值进行校正，以错误发现阳性率（false discovery rate，FDR）0.05为具有统计学意义，双侧检验。

1. 描述性分析：首先描述研究人群的一般人口学和生活方式特征。连续变量以 x¯ ± s表示，采用独立样本 t检验进行CHD发病或健康人群的组间比较。分类变量采用人数（%）表示，采用χ²检验进行CHD发病或健康人群的组间比较。

2. 单个代谢物与CHD发病的关联分析：在关联分析之前，采用基于秩的逆正态转换（rank-based inverse normal transformation，RINT）对代谢物水平进行预处理，使其趋近正态分布。经RINT处理后，代谢物水平基本服从均值为0、标准差为1的标准正态分布，后续分析所得的效应值即为经RINT转换后，代谢物浓度每增加一个标准差所对应的效应大小。采用Cox比例风险回归模型分析单一酰基肉碱或胆汁酸与CHD发病之间的关联。模型以年龄为时间尺度，调整性别、年龄、城乡分布、吸烟和饮酒状况，估计CHD发病的 HR值（95% CI）。

3. 代谢物评分与CHD发病的关联分析：根据酰基肉碱和胆汁酸的不同类别构建非加权评分，分析酰基肉碱、胆汁酸与CHD发病之间的总体效应。评分构建方法如下：（1）根据单一代谢物的分析结果，将预处理后的代谢物水平统一转化为升高CHD发病风险方向（即若某一代谢物与CHD发病呈正向关联，则不对该代谢物作任何处理；若某一代谢物与CHD发病呈负向关联，则取该代谢物水平的相反数）；（2）将转化后的代谢物水平分类求和，获得各类代谢物的水平评分。同样采用Cox比例风险回归模型分析代谢物评分与CHD发病之间的关联，模型设置与单一代谢物的分析相同。

4. 代谢物对CHD发病的预测能力：评估酰基肉碱和胆汁酸是否能够提升传统预测模型 ^［ 17 ］ （以下简称“传统模型”）对CHD发病的预测能力。将前述分析中的显著代谢物加入传统模型，绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线并计算曲线下面积（area under curve，AUC），采用DeLong检验比较加入代谢物的新模型与传统模型对CHD发病预测的准确性。

1. 研究人群总体特征：2 159名研究对象年龄为（53.1±9.8）岁，其中34.9%为男性，72.5%居住于农村地区。从不吸烟者、从不饮酒者占比最多，分别为72.1%和84.7%；文化程度为小学及以下者、家庭年收入≥20 000元者占比较多，分别为62.2%和75.1%；88.7%研究对象蔬菜摄入频率达7 d/周，超半数研究对象的水果（53.6%）和红肉（68.8%）摄入频率为1~6 d/周；BMI为（23.1±3.3）kg/m 2；体力活动水平为（26.0±15.7）MET-h/d。详见 表2 。

2. 不同疾病结局人群基本特征：随访（10.5±0.1）年，累计随访22 602.8人年。随访期间共观察到新发CHD病例140例，发病密度为6.2/千人年。与健康人群相比，CHD患者年龄较高、更多居住于城市、家庭年收入较低、每天摄入水果占比较多、体力活动水平较低（均 P0.05）。详见 表2 。

1. 单一酰基肉碱与CHD发病的关联：在全部40种酰基肉碱中，13种显示出与CHD发病之间的关联（原始 P＜0.05），其中4种呈正向关联，9种呈负向关联（ 图1 ）。经多重检验校正后，13种酰基肉碱中的3种与CHD发病存在关联（FDR＜0.05），均为短链酰基肉碱，包括酰基肉碱C3-OH、C5∶1和C5∶1-DC。酰基肉碱C3-OH与CHD发病风险呈正向关联，经RINT转换后的酰基肉碱C3-OH每增加1个标准差，CHD发病风险升高47.4%（ HR值=1.474，95% CI：1.230~1.767）。酰基肉碱C5∶1 和C5∶1-DC与CHD发病风险呈负向关联， HR值（95% CI）分别为0.761（0.637~0.909）、0.773（0.650~0.918）。

图1 酰基肉碱与CHD发病的关联

注：CHD为冠心病；FDR为错误发现阳性率； HR值（95% CI）为经基于秩的逆正态转换后代谢物浓度每升高1个单位，CHD的发病风险（95% CI）

2. 单一胆汁酸与CHD发病的关联：在全部的14种胆汁酸中，2种次级胆汁酸显示出与CHD发病之间的关联（原始 P＜0.05），均呈正向关联（ 图2 ）。经多重检验校正后，仅去氧胆酸（deoxycholic acid，DCA）与CHD发病存在关联（FDR＜0.05）， HR值（95% CI）为1.309（1.113~1.539）。

图2 胆汁酸与CHD发病的关联

注：CHD为冠心病；FDR为错误发现阳性率； HR值（95% CI）为经基于秩的逆正态转换后代谢物浓度每升高1个单位，CHD的发病风险（95% CI）

在对代谢物分类构建的评分与CHD发病的关联分析中，各类评分与CHD发病之间的关联均有统计学意义（FDR＜0.05）。初级胆汁酸评分与CHD发病关联的效应强度较高， HR值（95% CI）为1.245（1.108~1.398）；其余评分的效应强度相近， HR值点估计值范围在1.020~1.072之间。具体结果见 图3 。

图3 代谢物评分与CHD发病的关联

注：CHD为冠心病；FDR为错误发现阳性率； HR值（95% CI）为经基于秩的逆正态转换后代谢物浓度每升高1个单位，CHD的发病风险（95% CI）

将以上得到的4个关键代谢物（酰基肉碱C3-OH、C5∶1、C5∶1-DC和DCA）和代谢物评分分别加入CHD发病的传统模型中，得到的ROC曲线和AUC值如 图4 和 表3 所示。加入DCA的模型AUC（95% CI）为0.812（0.772~0.852），同时纳入4个关键代谢物的模型AUC（95% CI）为0.817（0.778~0.857）。与传统模型［AUC（95% CI）为0.803（0.761~0.845）］相比均增加（均 P＜0.05）。其余代谢物模型ROC曲线的AUC与传统模型差异均无统计学意义（均 P＜0.05）。

图4 酰基肉碱与胆汁酸对预测CHD发病风险的ROC曲线

注：CHD为冠心病；ROC为受试者工作特征

基于我国2 159名成年人的血浆代谢组学数据，本研究指出血浆酰基肉碱C3-OH和DCA水平与CHD发病风险呈正向关联，酰基肉碱C5∶1、C5∶1-DC与CHD发病风险呈负向关联；综合考虑酰基肉碱和胆汁酸的总体效应时，发现不同链长酰基肉碱和初级、次级胆汁酸均与CHD发病风险相关。研究发现的关键代谢物可提高传统模型对CHD发病的预测能力。

本研究发现酰基肉碱和胆汁酸水平与CHD发病风险之间存在关联，这一关联在既往研究中有所提及。有欧美学者发现，相比于健康对照，CVD患者血浆酰基肉碱或胆汁酸水平较高。研究者采用横断面设计，在47名研究对象中观察到几种短链和中链酰基肉碱在CVD患者中水平较高 ^［ 6 ］ ；采用回顾性研究设计，基于980名对象的酰基肉碱水平构建评分，发现相比于基线时评分处于最低四分位数者，最高四分位数组的研究对象在4.8年后发生CVD的比例更高 ^［ 7 ］ 。另有美国学者在536名超重或肥胖的成年人中，发现牛磺胆酸、甘胆酸等初次胆汁酸、牛磺去氧胆酸、甘氨去氧胆酸等次级胆汁酸均与动脉粥样硬化性心血管疾病未来十年发病风险相关，而DCA、甘氨石胆酸等则与发病风险无关 ^［ 11 ］ 。然而，本研究与以上研究结果的关联方向、显著代谢物种类等不完全一致。由于这些研究均基于欧美人群开展横断面或回顾性分析，且与本研究纳入酰基肉碱种类不尽相同，因此可能导致结果之间存在差异。本研究新鉴定出3个CHD相关代谢物，分别为酰基肉碱C3-OH、C5∶1、C5∶1-DC，既往研究曾报道酰基肉碱C3-OH与白细胞端粒长度 ^［ 18 ］ 、酰基肉碱C5∶1与慢性肾病 ^［ 19 ］ 、妊娠期血糖 ^［ 20 ］ 有关，它们对心血管代谢性疾病的作用有待进一步探索与验证。

本研究提示循环酰基肉碱和胆汁酸是机体代谢状态的重要生物标志物。对于酰基肉碱而言，其生理功能因链长而异，如短链酰基肉碱是支链氨基酸（branched-chain amino acid，BCAA）分解代谢的产物，中链和长链酰基肉碱则参与脂肪酸β氧化、反映线粒体功能 ^［ 3 ］ 。本研究发现的CHD相关酰基肉碱均为短链，可能由于其来源和所处通路与CHD有关。短链酰基肉碱的前体物质BCAA与动脉粥样硬化、缺血—再灌注损伤等多种病理机制以及心肌梗死、心力衰竭等疾病结局相关 ^{［ 21 , 22 ］} ，两类代谢物的浓度可相互影响，共同在CHD的发生发展中发挥作用 ^［ 23 ］ 。胆汁酸是有效的代谢和免疫信号分子，初级胆汁酸由肝脏中的胆固醇合成，随后被转运到肠道，在此被肠道微生物代谢并转化为次级胆汁酸 ^［ 4 ］ 。通过激活不同受体，胆汁酸可以调控广泛的共生代谢网络，包括葡萄糖、脂质、类固醇和外源代谢以及能量稳态等信号通路，从而影响宿主的代谢和免疫功能 ^［ 4 ］ 。法尼醇X受体（farnesoid X receptor，FXR）是胆汁酸受体之一，受不同种类胆汁酸的作用效果不同，如鹅去氧胆酸对其激动能力最强，而次级胆汁酸DCA则多在鹅去氧胆酸存在下作为FXR的拮抗剂发挥作用 ^［ 24 ］ 。这种对受体的亲和力和作用效果不同的现象，可能是本研究中初级和次级胆汁酸与CHD发病的关联存在差异的机制之一。

本研究具有一定的优势。第一，本研究基于一般人群的前瞻性随访资料，可评估酰基肉碱和胆汁酸在CHD一级预防中的作用；同时，研究剔除了调查前出现疾病结局的对象，时序关系明确，有效避免患者机体代谢紊乱而对关联结果造成干扰。第二，本研究的样本量较大、随访时间长，具有更高的统计效能，可以发现单一代谢物的长期健康效应。本研究也存在一定的局限性。第一，观察性研究的性质限制了本研究因果推断的证据等级，仍需后续的基础研究深入解析两类代谢物在CHD发病中的作用。第二，相比于既往研究，本研究中所采取的多重校正可能较为严格。

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