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如果在组学分析中出现一个与后续分析无关的小错误，你会怎么做呢？会不会选择性忽略呢？可能会吧，换做我，我也会，但是，这样我们就错过了以下论文的发表：Sci Adv、Nat Commun、PNAS、Genome Res、Cell Mol Life Sci、mBio等等。今天，让我们一起回顾一个小故事，一个由小错误开启的科学探究之旅。
首先呢，介绍一下相关研究的带头人，刘慧泉老师，来自西北农林科技大学植物保护学院，以小麦赤霉病病原禾谷镰孢（Fusarium graminearum）为主要研究对象。研究工作先后得到全国优秀博士论文作者专项基金、国家优秀青年科学基金、农业部“杰出青年农业科学家”、国家“万人计划”青年拔尖人才等人才项目资助。
表观遗传学，在不改变遗传物质DNA的前提下得到可遗传的基因表达或细胞表型的变化。其中，RNA编辑是重要的一种现象，而A-to-I mRNA编辑是重要的RNA编辑类型。众所周知，我们的DNA和RNA由5种碱基组成，包括AGCTU。但是，在哺乳动物中呢，有这样一类蛋白ADAR，他可以编辑mRNA上的密码子A (腺嘌呤) 变化成为I (次黄嘌呤)，这个I的密码子可以和C结合，于是就发挥了G的功能。尽管 A-to-I mRNA 编辑在动物中非常常见，但是由于在真菌的基因组中没有编码 ADAR 酶家族的基因，因此在过去一段时间，人们认为在真菌中不存在 A-to-I mRNA 编辑。
刘老师他们研究的对象禾谷镰孢是存在两种世代的，包括有性世代和无性世代（可以类比植物中的有性世代和无性世代）。我们可以简单理解为有性世代是传宗接代、产生下一代的过程。禾谷镰孢会造成小麦赤霉病，而小麦赤霉病是重要的粮食病害(Fig1)。小麦受害后综合粒重降低，发芽率下降，发芽势减弱，出粉率低，面粉质量差，色泽灰暗，商品价值降低。最重要的是病麦含有致呕毒素和类雌性激素等毒素，人畜食后可引起急性中毒，不宜观察，不慎食入之后会对我们产生危害。
Fig1 小麦赤霉病
真菌A-to-I mRNA编辑首次被观察到一种名为Puk1的蛋白激酶的mRNA中，而PUK1蛋白就是在性世代发展的后期发挥特异功能的。据说在当时，通过反向遗传学，一个师兄正在对PUK1进行功能验证，这个蛋白是有功能的，于是就测了一个转录组，但是转录组在中却发现，PUK1这个基因，总是少了一截儿。准确的说PUK1的mRNA存在了错误的内含子剪接 (Fig2)。如果没有这个错误预测的内含子的剪接，PUK1有两个提前终止密码子会使其截断成为无功能的蛋白 (Liu et al., 2016)。
Fig2 PUK1的功能、表达和RNA编辑 (Liu et al., 2016)
这下研究就卡住了，变得奇奇怪怪。一来我们平时做转录组，可能不会看那么细，二来，问题摆到这里，存在提前终止，但是并不会影响后续的差异表达分析，自然也不会影响课题的进程，那么是否要继续研究呢？答案在刘老师这里是肯定的。这个问题始终萦绕在刘老师心头，但迟迟没有解决；说来也是巧，有那么一天，学校实验室集体停电；于是呢，刘老师就跑到他媳妇儿那里打发时间，闲着没事，就抢过来媳妇的电脑随便找两篇文章看看吧。无巧不成书，突然逛着逛着，就看到了哺乳动物中报道的A-to-I mRNA，这不禁启发了刘老师，他想，这种现象会不会是引起基因少一截的原因呢。于是刘老师像是在海上漂流的哥伦布，在陌生的电脑上发现了新大陆的入口。
果不其然，正是mRNA上存在一个碱基从A变成了I，才导致PUK1的提前终止。那么在真菌中A-to-I mRNA这种现象是不是普遍存在的呢，于是带着这个疑问，刘老师开展了对于模式真菌粗糙脉孢菌的链特异性转录组测序。结果打破了常规的认知。确实，A-to-I mRNA编辑可能是广泛存在于真菌中的 (Liu et al., 2017)。
Fig3 A-to-I编辑位点的偏好与分布 (Liu et al., 2017)
进一步分析，做了一个call motif，他们发现，在真菌中A-to-I mRNA编辑存在着-1位U的偏好性 (Fig3)。然而，这种偏好性，却和我们普遍认知下动物中的偏好性大不相同。因为我们了解，像m6a啊，m5c啊这种修饰也好，RNA编辑也好，都是不同生物中普遍存在的保守机制 (Wang et al., 2016)。这里问题就来了，为什么会出现这种现象呢。
那么，真菌中A-to-I mRNA编辑依靠什么呢？会导致其与动物中的机制存在差异。
一般来说，A-to-I mRNA编辑依靠是脱氨酶的。尽管A-to-I mRNA 编辑在动物中非常常见，但是由于在真菌的基因组中没有编码 ADAR 酶家族的基因，所以我们并不清楚是什么蛋白发挥了编辑的作用 (Bian et al., 2019)。于是经过分析鉴定到禾谷镰孢中共有10个脱氨酶。敲除所有脱氨酶发现，ADAT2和ADAT3敲除致死，而其他的蛋白均不影响有性过程。因此ADAT2和ADAT3就作为了候选的编辑蛋白。但是ADAT2和ADAT3的同源蛋白TadA，是负责tRNA的A-to-I编辑的 (Fig4) (Wang et al., 2016; Liu et al., 2017)。
Fig4 ADAT的进化、表达和功能 (Wang et al., 2016)
在原核生物中A-to-I tRNA编辑的位点位于tRNA的反密码子环上，有-1位U的密码子偏好性 (Bar-Yaacov et al., 2017)。植物叶绿体和原核生物中具有相似的A-to-I编辑现象，这一研究也论证了ADAT2和ADAT3可能是候选的编辑酶。进一步，通过遗传学与分子生物学分析揭示了真菌中A-to-I mRNA编辑的酶复合体，并明确了其起源、进化和调控机制。该研究为真菌病害防控和基因编辑工具开发提供了重要的新思路。论证了Tad2-Tad3异源二聚体是真核生物中保守的tRNA特异的腺苷脱氨酶，主要负责tRNA反密码子环上第34位的A-to-I编辑。真菌中特异性进化出的一种蛋白Ame1打破了这一底物识别的限制，使得Tad2-Tad3-Ame1三元复合体能够识别和编辑mRNA (Fig5) (Feng et al., 2024)。顺便一提，这篇文章我个人感觉真的是发低了啊。
Fig5 Tad2-Tad3-Ame1三元复合体能够识别和编辑mRNA (Feng et al., 2024)
进一步的，该课题组通过机器学习的手段，结合RNA的二级结构，发现了真菌中A-to-I mRNA编辑位点具有高度的选择性，会选择在茎环结构处进行编辑。这一点也非常值得我们发散思维联系一下，相似的比如IRES，核糖体插入位点，也是会被茎环结构所招募。这些也都是我们生物中顺式作用元件调控的特殊却有共性的现象 (Feng et al., 2022)。
解析了A-to-I mRNA编辑是什么，我们需要进一步了解一下A-to-I mRNA编辑究竟是用来做什么的。
A-to-I mRNA编辑在哺乳动物，特别是人 (Homo sapiens) 上发现的很早，但是，现象有了，却一直没有很好的解释生物学问题。因为动物的内含子长度相较于植物与真菌，是显著增大的，而A-to-I mRNA编辑有大多都落在了内含子上，使得其大多没有什么生物学意义。而前两年让我们闻风丧胆的新冠疫情，大家应该还历历在目吧。有研究表明，人类的A-to-I mRNA编辑可能会通过随机编辑病毒的RNA基因组达到抗病毒的作用 (Di Giorgio et al., 2020)。这个研究是很有意义的，但是否可以利用这个研究来开发抑制病毒的生物技术工具还尚未可知。
与人类不同，真菌中A-to-I mRNA编辑就大有可为了。首先，非同义编码在真菌中A-to-I mRNA编辑占到的比例为52.4%，远高于动物。这是否就说明真菌中A-to-I mRNA编辑是可以直接调控蛋白合成，从而调控生物进程的呢。而且这种编码在近缘种中还是保守的，这说明真菌中A-to-I mRNA编辑是一种普遍的调控机制 (Liu et al., 2017)。
通过对于高编辑位点的系统鉴定，更是证明了上述的生物学观点。刘老师团队发现，存在两个蛋白CME5和CME11，在编辑前后是可以影响真菌的生物学功能的。其中，过度编辑的CME5突变体在有性生殖中是正常的，但编辑不足的CME5突变体是存在严重缺陷，这意味着在这个位点编辑相比原来的序列具有更高的适应性。有趣的是，分别表达编辑不足或过度编辑的CME11等位基因都会存在缺陷 (Xin et al., 2023)。而同时表达两种等位基因则可以获得正常的表型，这就表明了只有在两种蛋白同时存在的时候，最具有适应性 (Fig6)。
Fig6 CME5和CME11中CME位点相对于基因组突变的适应性优势(Xin et al., 2023)
此外，团队通过分子生物学、遗传学和进化发育生物学研究手段发现，禾谷镰孢在进化过程中产生了大量与逆境响应有关的基因，这些基因在其生活史有性阶段发挥关键作用，但在无性阶段却会降低病原菌对逆境胁迫的适应能力。这些基因具有拮抗多效性，虽然对生殖有利，但对生存不利，但在生存与生殖权衡之中禾谷镰孢优先选择了生殖。进一步研究发现，A-to-I mRNA编辑在进化过程中驱动这些基因发生提前终止突变，使其成为假基因 (Qi et al., 2024)。
这些研究提供了令人信服的实验证据，证明了，在真菌中，长期以来人们所怀疑的RNA编辑适应性的优势。未来的研究方向还很多，也希望刘老师会带来更多更有意义的研究成果。我们的生物体像一大张充满着小bug的老代码，他奇奇怪怪的运行着，内在规律与意义纷繁复杂，值得我们的探究，同时相信很多人也会像刘老师一样，像我们一样会对这些奇奇怪怪的生物学现象产生兴趣并深入研究进而应用。
Reference
Bar-Yaacov D, Mordret E, Towers R, Biniashvili T, Soyris C, Schwartz S, Dahan O, Pilpel Y. 2017. RNA editing in bacteria recodes multiple proteins and regulates an evolutionarily conserved toxin-antitoxin system. Genome Res 27(10): 1696-1703.
Bian Z, Ni Y, Xu JR, Liu H. 2019. A-to-I mRNA editing in fungi: occurrence, function, and evolution. Cell Mol Life Sci 76(2): 329-340.
Di Giorgio S, Martignano F, Torcia MG, Mattiuz G, Conticello SG. 2020. Evidence for host-dependent RNA editing in the transcriptome of SARS-CoV-2. Sci Adv 6(25): eabb5813.
Feng C, Cao X, Du Y, Chen Y, Xin K, Zou J, Jin Q, Xu JR, Liu H. 2022. Uncovering Cis-Regulatory Elements Important for A-to-I RNA Editing in Fusarium graminearum. mBio 13(5): e0187222.
Feng C, Xin K, Du Y, Zou J, Xing X, Xiu Q, Zhang Y, Zhang R, Huang W, Wang Q, et al. 2024. Unveiling the A-to-I mRNA editing machinery and its regulation and evolution in fungi. Nat Commun 15(1): 3934.
Liu H, Li Y, Chen D, Qi Z, Wang Q, Wang J, Jiang C, Xu JR. 2017. A-to-I RNA editing is developmentally regulated and generally adaptive for sexual reproduction in Neurospora crassa. Proc Natl Acad Sci U S A 114(37): E7756-E7765.
Liu H, Wang Q, He Y, Chen L, Hao C, Jiang C, Li Y, Dai Y, Kang Z, Xu JR. 2016. Genome-wide A-to-I RNA editing in fungi independent of ADAR enzymes. Genome Res 26(4): 499-509.
Qi Z, Lu P, Long X, Cao X, Wu M, Xin K, Xue T, Gao X, Huang Y, Wang Q, et al. 2024. Adaptive advantages of restorative RNA editing in fungi for resolving survival-reproduction trade-offs. Sci Adv 10(1): eadk6130.
Wang C, Xu J-R, Liu H. 2016. A-to-I RNA editing independent of ADARs in filamentous fungi. RNA Biology 13(10): 940-945.
Xin K, Zhang Y, Fan L, Qi Z, Feng C, Wang Q, Jiang C, Xu JR, Liu H. 2023. Experimental evidence for the functional importance and adaptive advantage of A-to-I RNA editing in fungi. Proc Natl Acad Sci U S A 120(12): e2219029120.
END
编辑 | Narcissus
供稿 | 李翔
审核 | 农心生信工作室
