2017年FDA批准诺华公司的CAR-T细胞治疗产品上市，为难治性B细胞急性淋巴细胞白血病的治疗带来了莫大的希望，那么CAR-T治疗的原理是什么呢？
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CAR-T中的T一般指的是αβT，这又是什么意思呢？T细胞表面有T细胞受体(TCR)，可以识别和结合抗原提呈细胞呈递的抗原，TCR由两条多肽链组成（联想一下工具钳子），每条链分为可变区(V，也就是钳子头的前1/2)和恒定区(C，也就是钳子头的后1/2和钳子把)。可变区与抗原肽结合，恒定区参与信号传导。TCR的两条肽链通过二硫键连接，形成抗原肽结合沟槽（也就是钳子的的连接处）。TCR的两条肽链有α、β、γ、δ四种，其中α/β链存在于辅助性T细胞Th和细胞毒性T细胞表面，占T细胞的95%，而γ/δ链则存在于其他类型的T细胞表面，占T细胞的5%。
那么为什么CAR-T治疗选择了αβT，而不是γδT细胞呢？它们除了数量，还有什么差别呢？接下来就有请今天的主角：αβT和γδT细胞。
等会儿，在读正文之前，我们先用通俗易懂的话来复习几个学过的概念：
①主要组织相容性复合体MHC：它其实就是抗原识别的中介，它作为中介，是没有对抗抗原，也就是病毒、细菌的能力的，所以它需要带着细菌、病毒去找大佬，以杀死细菌和病毒等抗原。MHC主要分为MHC-I和MHC-II。MHC-I几乎表达在所有有核细胞表面，如果这些细胞已经被细菌、病毒感染了，那么MHC-I就能识别到，然后带着这个感染的细胞去找细胞毒性T细胞（CTL），从而清除被细菌病毒感染的细胞。而MHC-II主要表达在抗原提呈细胞，如巨噬细胞、树突状细胞、B细胞等表面，这些细胞可不是一般的细胞，当MHC-II识别到细胞外有细菌、病毒，就带着这些细胞去吃掉它们，再去找辅助性T细胞（Th）帮忙清除细菌和病毒。进而激活体液免疫和细胞免疫应答。
②细胞免疫和体液免疫：说回刚才的MHC，MHC-I直接带着细菌病毒去找大佬（细胞毒性T细胞），激活的就是细胞免疫。而MHC-II是有带着B细胞去吃掉细菌病毒，再去找大佬的（辅助性T细胞），这时候B细胞会产生抗体，那么激活的就是体液免疫，但是MHC-II也带着巨噬细胞、树突状细胞去了哦，所以也激活了细胞免疫。
③先天免疫和适应性免疫：先天免疫又称为非特异性免疫或内在免疫，是机体遇到病原体攻击是最先站出来反击的，积极参与先天免疫的是吞噬细胞，包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞等。适应性免疫又称特异性免疫或获得性免疫，主要由B和T淋巴细胞负责，它们接收并清除抗原提呈细胞带来的抗原（也就是病原体），引发体液免疫和细胞免疫。
④MHC限制性：无规矩不成方圆，免疫系统也要各司其职，不能认领别人的功劳，T细胞在清除MHC带来的细菌病毒时，要看看是谁带来的，如Th细胞只识别MHC-II类分子，而CTL细胞只识别MHC-I类分子，这就叫MHC限制性。
读到这里，有意思的事情发生了，Th细胞和CTL细胞是受MHC限制的，而这两种细胞都是αβT细胞。那么γδT细胞是不是不受MHC限制呢？那它对抗原的反应性是不是就更高了呢？那用它去清除细菌、病毒、肿瘤的效果是不是更好呢？那么为什么还要选择αβT细胞作为CAR-T治疗的对象呢？让我们带着问题进入正文。
1、CAR-T的构建原理
目前CAR-T治疗使用的T细胞指的是αβT细胞，我们首先来了解一下CAR-T构建的原理（图1）。当T细胞遇到抗原呈递细胞或肿瘤细胞时，T细胞受体（TCR）和CD3复合物与CD4或CD8一起识别MHC复合物呈递的肽，然后触发TCR信号级联反应，导致T细胞活化（图1A）。第一代CAR主要涉及两部分：细胞外部分的scFv和细胞内部分的CD3ζ链。ScFv结构域可以识别肿瘤表面抗原，CD3ζ链会直接激活T细胞。第二代CAR包含一个共刺激结构域，即4-1BB或CD28信号结构域。第三代CAR具有4-1BB和CD28信号转导结构域（图1B）。这些结构的增加加强了细胞因子产生和响应靶标刺激的增殖，降低了CAR-T细胞的细胞毒性。FDA批准的6种CAR-T产品均采用第二代 CAR 构建体，由抗原结合结构域、铰链区、跨膜区、共刺激结构域和T细胞活化结构域构成。这些产品用于治疗B细胞淋巴瘤、B细胞白血病和多发性骨髓瘤（图1C）。
2、CAR-T细胞治疗的挑战和攻克实体瘤的工程策略
近年来，人们投入了大量精力来改进实体瘤的CAR-T细胞疗法，目前已在血液肿瘤中取得了可喜的成绩。但是，虽然在实体瘤中显示出活性迹象，但迄今为止临床试验的结果令人失望，没有观察到持续较高的持久反应率。
究其原因，治疗实体瘤对 CAR-T 细胞构成了三大挑战：肿瘤异质性、肿瘤浸润和抑制性肿瘤微环境（TME）。肿瘤抗原有两种类型，一种是仅在肿瘤细胞中表达的肿瘤特异性抗原 （TSA） 和也可以在正常细胞中表达的肿瘤相关抗原 （TAA）。同时，肿瘤细胞也可能在不同水平表达肿瘤抗原。要克服异质性，重点时实现多靶点靶向。研究人员设计了具有两种不同 scFv （TanCAR） 的 CAR 或表达两种识别不同抗原的不同 CAR （双特异性 CAR），还探索了CAR-T 细胞的额外修饰以增强其靶向能力，使 CAR-T 细胞能够分泌双特异性 T 细胞接合器，后者连接肿瘤抗原和 CD3 复合物以启动 T 细胞肿瘤杀伤。实体瘤还具有限制 CAR-T 细胞浸润的物理屏障和细胞外基质。为了克服这一挑战，研究人员尝试了 CAR-T 细胞的局部递送、工程化表达趋化因子受体的 CAR、靶向蛋白酶成纤维细胞活化蛋白 （FAP）的 CAR 或细胞外基质 （ECM）修饰的 CAR-T 或溶瘤病毒。免疫抑制性 TME 是另一个重大挑战，包括抑制性免疫细胞浸润、免疫抑制因子（如 TGF-β）以及化学环境改变。研究人员使用基因缺失、抗 PD-1/PD-L1 抗体或 T 细胞自分泌抗体来阻断 PD-1 等免疫检查点，还设计了表达细胞因子或细胞因子受体的 CAR，用 PD-1 或 TGF-β 中的激活结构域代替抑制结构域作为转换受体，并删除 T 细胞内负调节因子或过表达 T 细胞功能增强剂来增强CAR-T细胞抗肿瘤功能（图2）。
图2. CAR-T面临的挑战和攻克实体瘤的工程策略
3、CAR-T的副作用
尽管 CAR-T 疗法在血液系统恶性肿瘤中取得了临床成功，但仍然有危及生命的副作用，例如① CRS 和②神经毒性。
①CRS 是一种全身性疾病，在最严重的病例中表现为全身症状、发热、低血压和器官功能障碍，它由细胞因子的大量释放引发，IL-1 和 IL-6、CAR-T 细胞和 TME 细胞在癌细胞识别后起着关键的致病作用。
②神经毒性，也称为免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS），是一种中毒性脑病，临床上与 CRS 的发病机制密切相关。
因此研究人员致力于开发新的CAR-免疫治疗，例如CAR-γδT细胞、CAR-NK细胞、CAR-巨噬细胞等。今天我们要介绍的是CAR-γδT细胞。
γδT细胞是一种进化保守的T细胞系，它可连接先天免疫和适应性免疫，比αβT细胞亚群具有更广泛的反应性。此外，γδT细胞不受个体主要组织相容性复合体分子的限制，“现成的”治疗性γδT细胞生物库有能力从健康供体中产生，因此γδT细胞有望用于下一代免疫疗法，以覆盖更多样化的患者群体，并可能减少不良反应。
相对于αβT细胞，γδT细胞因其在桥接先天免疫和适应性免疫方面的独特作用而脱颖而出。它们靶向并杀死癌细胞，不受主要组织相容性复合体 （MHC） 分子的限制，并且许多亚群自然定位于组织并在组织内发挥作用，容易识别新抗原载量低的肿瘤，识别到癌症表面抗原的潜在多样性，因此对癌细胞有更广泛的识别，包括那些缺乏 MHC I 类的细胞。γδT 细胞擅长分泌干扰素γ （IFN-γ） 和肿瘤坏死α因子 （TNF-α） 等细胞因子，它们可以通过 Fas/FasL 和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 （ADCC） 等机制直接消除肿瘤细胞，它们能够迁移到外周组织并对靶细胞快速反应，再加上它们通过协调CD 8 +αβT细胞记忆的能力，向αβT细胞交叉递呈肽抗原，并且它们不参与移植物抗宿主病（GvHD），使其成为现成细胞治疗解决方案的理想选择（表1）。
表1. γδT细胞的优势
1、γδTCR在识别天然抗原方面的功能与抗体类似（抗体样识别），但由于TCRδ V-D-J基因片段重组可以实现多样性，因此肿瘤靶点的范围可能更广泛，包括以高水平表达和/或多种不同癌症的形态改变的自身表面抗原（表2）。
表2. 直接结合的γδTCRs的配体
2、γδT细胞将抗体样识别与颗粒酶和穿孔素的高表达相结合，促进了靶细胞溶解，而不需要携带FcR的辅助细胞，有一定的向αβT细胞递呈抗原的能力，以及激活自然杀伤细胞受体（NKR）的表达，包括天然细胞毒性受体和FcR，可以补充TCRγδ介导的癌细胞识别。
我们在免疫学课本上学到的T细胞识别抗原的机制都是抗原结合在抗原提呈细胞例如MHC的胞外段，继而提呈并活化T细胞（其实课本中的T细胞是指αβT细胞，机制就如正文前概念①所述）。而γδ T细胞具有自己独特的抗原识别方式，它不依赖于MHC，那它是怎么识别的呢？研究人员发现肿瘤细胞和病原体都能产生一类被称为“磷酸抗原pAg”的脂类代谢产物，这些物质能够激活人体外周血中最大类的γδ T细胞，也就是Vγ9Vδ2 T细胞（人血液中的γδT细胞大多使用Vδ2链，它通常与Vγ9链配对。Vγ9Vδ2 T细胞占外周血γδ T细胞的50-95%）。
具有胞内和胞外结构域的跨膜乳糜蛋白BTN3A充当了磷酸抗原的递呈分子，晶体学证据表明磷酸抗原与BTN3A1的细胞内B30.2结构域结合后，形成了与BTN2A1直接结合的复合界面，形成了以磷酸抗原分子为中心，周围以不同的亲和力粘合BTN3A的结构。从而触发细胞外构象变化，使靶细胞能够被Vγ9Vδ2 T细胞识别并启动T细胞免疫，进而杀灭病原和肿瘤细胞。这种“由内而外”的信号传导模式帮助磷酸抗原激活了γδ T细胞（图3）。羟甲基丁二烯基焦磷酸（HMBPP）是一种外源性磷酸抗原，异戊烯二磷酸（DMAPP）和异戊二烯二磷酸（IPP）在肿瘤细胞发生发展过程中积聚。HMBPP激活Vγ9Vδ2 T细胞的能力比后两种强很多。
图3.化学探针方法支持不对称二聚体构型参与 Vγ9Vδ2 T 细胞活化
为什么说是“现成”的呢？这是因为γδT细胞不受MHC限制，因此它们可以作为同种移植物进行输血，几乎没有发生移植物抗宿主病（GVAR）的危险，而GVAR会混淆同种异基因αβT细胞疗法。因此γδ过继细胞疗法（ACT）可以提前从健康捐赠者中准备好并现货给药。
研究人员成功利用了γδT细胞识别抗原的独特机制设计免疫治疗药物，开发了人类γδT细胞功能的小分子激活剂和抑制剂。例如，在中国济南复大肿瘤医院进行的同种异体Vγ9Vδ2 T细胞的I期试验中，安全性得到证实，18名接受5次或5次以上输注的晚期肝癌或肺癌患者的生存期大大延长（NCT03183206，NCT03183219，NCT03183232，NCT03180437）。由于Vγ9Vδ2 T细胞数量有限，Vγ9Vδ2 T细胞激活与αβT细胞激动相比不太可能引起不良事件。基于BTN3A分子在Vγ9Vδ2 T细胞活化中的作用，ImCheck Therapeutics （Marseille, France）开发了BTN3A特异性激动剂抗体，替代磷酸抗原驱动TCR活化。有证据表明，在用Vγ9Vδ2 T细胞重建的异种移植物模型中有肿瘤抑制作用，一种抗体（ICT0）已经在血液肿瘤和实体瘤的I/IIa期临床试验中，也取得了不错的结果（NCT04243499，NCT05307874）。更具有突破性的是，用αβT细胞转导的CAR-Vγ9Vδ2 T细胞已作为针对多发性骨髓瘤的ACT应用于I期研究（NCT04688853）。表3显示了正在进行的γδT细胞治疗癌症的临床试验（包括血液肿瘤和实体瘤）。
表3. 正在进行的基于γδT细胞的癌症临床试验
由于γδT细胞在外周血中较少，只占T细胞的5%，体外扩增比较困难，而且目前尚没有成熟的方法去解决这个问题。但是有研究发现，使用唑来膦酸和白介素-2 (IL-2)对胶质母细胞瘤(GBM)患者的Vγ9Vδ2 T细胞进行扩增，随后用甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)基因转导细胞，该基因赋予对替莫唑胺(TMZ)的抗性，替莫唑胺是GBM的标准化疗，其通过引起基因组损伤，可诱导Vγ9Vδ2 T细胞的TCR和NKR抗原。MGMT转导的Vγ9Vδ2 T细胞通过用于TMZ递送的Rickham导管在残余肿瘤部位附近给药。用于Vγ9Vδ2 T细胞制备和维持的改进方法提供了不断的局部施用细胞的机会。该方法已成功应用于四种原发性和难治性GBM的人-鼠异种移植模型，并已投入临床应用（表3）。
目前基于γδT细胞的免疫疗法仍需要进一步优化，根据γδT细胞的特点、识别抗原的独特方式来构建适合的CAR分子，并且相关的研究仍然较少，仍需要投入大量的精力从血液系统肿瘤和实体瘤、CAR-NK细胞、CAR-巨噬细胞等进行研究。
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参考文献：
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