顾永鹏,刘洁,朱贞宝,等.核孔蛋白43在肝细胞癌组织中的表达及其对患者预后和肝癌细胞增殖与迁移的影响[J].中华消化外科杂志, 2024, 23(11): 1437-1444. DOI: 10.3760/cma.j.cn115610-2024 1026-00468.
● 本文发表在《中华消化外科杂志》2024年第23卷第11期，欢迎阅读、引用![]()
张雷达教授
![]()
谢传明教授![]()
顾永鹏医师
目的 探讨核孔蛋白43（NUP43）在肝细胞癌组织中的表达及其对患者预后和肝癌细胞增殖与迁移的影响。方法 采用回顾性队列研究方法和实验研究方法。收集2008年1月至2012年12月陆军军医大学第一附属医院收治的102例肝细胞癌患者的临床病理资料；男83例，女19例；年龄为56（19~87）岁。采用免疫组织化学染色分析NUP43在肝细胞癌组织中的表达。体外培养肝癌HepG2和SK‑HEP‑1细胞，采用蛋白质印迹法验证细胞转染Flag‑NUP43过表达质粒后的效果。采用CCK-8、细胞体外迁移实验分析过表达NUP43对HepG2和SK‑HEP‑1细胞功能的影响。正态分布的计量资料以x±s表示，组间比较采用独立样本t检验。偏态分布的计量资料以M（范围）表示。计数资料以绝对数表示，组间比较采用配对χ²检验。采用Kaplan‑Meier法计算生存时间，Log‑rank检验进行生存分析。采用R 4.2.1软件绘制生存曲线。单因素和多因素分析采用COX比例风险回归模型。结果 （1）NUP43在肝细胞癌与癌旁组织中的表达情况及高低表达患者临床病理特征分析。免疫组织化学染色结果显示：NUP43主要表达于细胞质和细胞核膜。102例肝细胞癌组织样本中，NUP43低表达49例，NUP43高表达53例；102例肝细胞癌癌旁组织样本中，NUP43低表达80例，NUP43高表达22例；肝细胞癌与癌旁组织中NUP43表达比较，差异有统计学意义（χ²=16.505，P<0.05）。102例肝细胞癌组织样本中，NUP43低表达和高表达患者肿瘤长径、病理学分级、肝内转移比较，差异均有统计学意义（χ²=5.104，23.217，4.169，P<0.05）。（2）肝细胞癌患者生存情况及影响预后的因素分析。102例肝细胞癌患者随访时间为17.9（0.1~107.9）个月。NUP43低表达和高表达患者术后1、3、5年总生存率分别为79.59%、53.06%、34.69%和52.83%、18.87%、9.43%，两者生存情况比较，差异有统计学意义（χ²=27.071，P<0.05）。多因素分析结果显示：性别、NUP43表达、TNM分期、病理学分级是肝细胞癌患者术后生存的独立影响因素（风险比=1.846，2.206，2.040，2.177，95%可信区间为1.231~2.768，1.419~3.429，1.322~3.148，1.377~3.254，P<0.05）。（3）过表达NUP43对肝癌HepG2和SK‑HEP‑1细胞增殖和迁移能力的影响。蛋白质印迹法检测结果显示：转染Flag‑NUP43过表达质粒可显著上调HepG2和SK‑HEP‑1细胞中NUP43的表达。CCK‑8实验结果显示：HepG2细胞转染对照质粒和Flag‑NUP43过表达质粒后，细胞增殖指数分别为0.79±0.07和1.47±0.05，两者比较，差异有统计学意义（t=19.402，P<0.05）；SK‑HEP‑1细胞转染对照质粒和Flag‑NUP43过表达质粒后，细胞增殖指数分别为0.59±0.05和0.95±0.05，两者比较，差异有统计学意义（t=15.753，P<0.05）。细胞体外迁移实验结果显示：HepG2细胞转染对照质粒和Flag⁃NUP43过表达质粒后，细胞迁移数分别为（188±8）个和（595±13）个，两者比较，差异有统计学意义（t=46.192，P<0.05）；SK‑HEP‑1细胞转染对照质粒和Flag‑NUP43过表达质粒后，细胞迁移数分别为（136±10）个和（447±20）个，两者比较，差异有统计学意义（t=24.721，P<0.05）。结论 NUP43在肝细胞癌组织中的表达显著高于癌旁组织。性别、NUP43表达、TNM分期、病理学分级是肝细胞癌患者术后生存的独立影响因素。过表达NUP43可显著促进肝癌HepG2和SK‑HEP‑1细胞的增殖和迁移能力。
肝肿瘤；核孔蛋白43；预后；危险因素；细胞增殖；细胞迁移
肝细胞癌是一种起病隐匿、进展迅速、预后较差的恶性肿瘤。根据最新的全球肿瘤流行病学统计资料，肝细胞癌的发病率及死亡率分别居恶性肿瘤的第6位及第3位［1‑3］。肝细胞癌的早期发现和早期诊断是决定患者预后的关键因素，早期肝细胞癌患者5年生存率可>50%，而晚期肝细胞癌患者5年生存率<20%［4‑5］。因此，对于慢性肝炎患者等高危人群，定期进行肝细胞癌筛查至关重要。目前，肝细胞癌的早期诊断仍面临挑战，许多患者发现时已至中晚期［6-14］。且有效诊断与治疗方式仍然匮乏［15］。因此，临床上亟待开发新的分子靶点，用于早期肝细胞癌患者的诊断、风险分析和靶点治疗［16‑23］。核孔蛋白43（nucleoporin 43，NUP43）是构成核孔复合体的关键成分之一。这些复合体形成核孔，是细胞核与细胞质之间进行物质交换的通道，允许大分子如蛋白质和mRNA在其中进行双向运输。有研究结果显示：NUP43通过促进PD‑L1/nPD‑L1/PD‑L1反馈回路促进结直肠癌的发生发展和转移［24］。另有研究结果显示：NUP43可以作为降低乳腺癌预后的独立危险因素，是诊断乳腺癌的潜在生物标志物［25］。但NUP43与肝细胞癌的临床关系尚不明确，本研究收集2008年1月至2012年12月我科收治的102例肝细胞癌患者的临床病理资料，分析NUP43在肝细胞癌组织中的表达及其对患者预后和肝癌细胞增殖与迁移的影响。
收集102例肝细胞癌患者的临床病理资料；男83例，女19例；年龄为56（19~87）岁。所有患者术中取新鲜癌及癌旁组织（距癌组织5cm）标本。本研究通过我院医学伦理委员会审批，批号为KY2020127。患者及家属均签署知情同意书。肝癌HepG2和SK‑HEP‑1细胞来源于美国模式菌种收集中心。NUP43多克隆兔来源抗体购于美国Invitrogen公司（PA5‑55514）。LipofectamineTM 2000购于美国Thermo Fisher公司（18324012）。Flag⁃NUP43过表达质粒购于吉凯基因公司（97569‑1）。兔二步法检测试剂盒和DAB染色试剂盒购于中杉金桥（PV‑9001和ZLI‑9019）。采集的组织样本固定于甲醛溶液中，并使用石蜡进行包埋处理，随后切成5 μm厚连续切片。免疫组织化学染色采用兔二步法检测试剂盒和DAB染色试剂盒，操作流程遵循说明书。NUP43抗体稀释比例为1∶200。由2位病理科医师双盲阅片后进行独立评估。HepG2和SK‑HEP‑1细胞分别转染对照质粒和Flag‑NUP43过表达质粒，转剂试剂为LipofectamineTM 2000，48 h后裂解细胞收集总蛋白。蛋白样品上样于10% PAGE胶中，电泳条件为80V、30min和110V、70min。电泳完毕后，将蛋白样品转移至硝酸纤维膜，电压条件为80V、2h。采用5%脱脂奶粉溶液封闭1h，一抗4℃孵育过夜，次日常温孵育二抗1h后显影。重复3次上述操作。HepG2和SK-HEP-1细胞按3000个/孔接种于96孔板内，分别转染对照质粒和Flag‑NUP43过表达质粒。培养72h后，通过酶标仪在450nm波长条件下测量吸光度。重复3次上述操作。HepG2和SK‑HEP‑1细胞分别转染对照质粒和Flag‑NUP43过表达质粒。培养48h后，细胞被消化并按1×105个/孔接种到24孔板的Transwell小室中。每孔中加入600μL的完全培养基，小室中加入200μL无血清培养基中重悬的细胞。经过24h的标准培养后，使用4%的多聚甲醛对细胞进行固定，持续20min，接着用结晶紫进行染色，持续30min。未穿过小室的细胞被擦拭掉。最后，在100倍的放大视野下对穿过的细胞进行拍照和计数。重复3次上述操作。纳入标准：（1）行肝细胞癌切除术。（2）术后组织病理学检查类型为肝细胞癌。（3）临床病理和病历资料完整。排除标准：（1）非肝细胞癌因素导致死亡。（2）围手术期死亡。（3）合并其他恶性肿瘤。（4）术前行介入手术或者其他方式治疗。观察指标：（1）NUP43在肝细胞癌与癌旁组织中的表达情况及高低表达患者临床病理特征分析。（2）肝细胞癌患者生存情况及影响预后的因素分析。（3）过表达NUP43对肝癌HepG2和SK‑HEP‑1细胞增殖和迁移能力的影响。评价标准：免疫组织化学染色结果通过评估染色的深浅和阳性细胞所占比例打分。0分：阴性，即没有染色的样本；1~4分：弱表达；5~8分：中等表达；9~12分：高表达。在这个评分系统中，阴性、弱表达和中等表达的样本统一被界定为低表达［26］。应用SPSS 26.0统计软件进行分析。正态分布的计量资料以x±s表示，组间比较采用独立样本t检验。偏态分布的计量资料以M（范围）表示。计数资料以绝对数表示，组间比较采用配对χ²检验。采用Kaplan‑Meier法计算生存时间，Log‑rank检验进行生存分析。采用R 4.2.1软件绘制生存曲线。单因素和多因素分析采用COX比例风险回归模型。P<0.05为差异有统计学意义。一、NUP43在肝细胞癌与癌旁组织中的表达情况及高低表达患者临床病理特征分析免疫组织化学染色结果显示：NUP43主要表达于细胞质和细胞核膜。见图2。102例肝细胞癌组织样本中，NUP43低表达49例（阴性14例、弱表达15例、中等表达20例），NUP43高表达53例；102例肝细胞癌癌旁组织样本中，NUP43低表达80例（阴性45例、弱表达21例、中等表达14例），NUP43高表达22例；肝细胞癌与癌旁组织NUP43表达比较，差异有统计学意义（χ²=16.505，P<0.001）。102例肝细胞癌组织样本中，NUP43低表达和高表达患者肿瘤长径、病理学分级、肝内转移比较，差异均有统计学意义（P<0.05），而性别、年龄、TNM分期、血管侵犯、淋巴结转移、远处转移比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。102例肝细胞癌患者随访时间为17.9（0.1~107.9）个月。NUP43低表达和高表达患者术后1、3、5年总生存率分别为79.59%、53.06%、34.69%和52.83%、18.87%、9.43%，两者生存情况比较，差异有统计学意义（χ²=27.071，P<0.001）。见图3。单因素分析结果显示：性别、NUP43表达、肿瘤长径、TNM分期、病理学分级、血管侵犯是影响肝细胞癌患者术后总生存率的相关因素（P<0.05），年龄、肝内转移、淋巴结转移、远处转移不是影响肝细胞癌患者术后总生存率的相关因素（P>0.05）。见表2。多因素分析结果显示：性别、NUP43表达、TNM分期、病理学分级是肝细胞癌患者术后总生存率的独立影响因素（P<0.05）。见表3。三、过表达NUP43对肝癌HepG2和SK⁃HEP‑1细胞增殖和迁移能力的影响
蛋白质印迹法检测结果显示：与转染对照质粒比较，转染Flag‑NUP43过表达质粒可显著上调HepG2和SK‑HEP‑1细胞中NUP43的表达。见图4。CCK‑8实验结果显示：HepG2细胞转染对照质粒和Flag‑NUP43过表达质粒后，细胞增殖指数分别为0.79±0.07和1.47±0.05，两者比较，差异有统计学意义（t=19.402，P<0.001）；SK‑HEP‑1细胞转染对照质粒和Flag‑NUP43过表达质粒后，细胞增殖指数分别为0.59±0.05和0.95±0.05，两者比较，差异有统计学意义（t=15.753，P<0.001）。细胞体外迁移实验结果显示：HepG2细胞转染对照质粒和Flag‑NUP43过表达质粒后，细胞迁移数分别为（188±8）个和（595±13）个，两者比较，差异有统计学意义（t=46.192，P<0.001）；SK‑HEP‑1细胞转染对照质粒和Flag‑NUP43过表达质粒后，细胞迁移数分别为（136±10）个和（447±20）个，两者比较，差异有统计学意义（t=24.721，P<0.001）。肝细胞癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤，寻找影响患者预后的特异性标志物十分重要［2，27‑56］。在真核细胞中，细胞核膜的作用为分离细胞质和细胞核，并调控两者之间的物质交换，而核孔复合物是实现该功能的关键通道［57‑60］。已有的研究结果显示：NUP43的表达增加与结直肠癌细胞核内PD⁃L1的蓄积有关，可提高肿瘤细胞免疫逃逸的机会［24］。此外，在乳腺癌中，NUP43也被作为潜在的肿瘤标志物，成为可能的治疗靶点［61］。NUP43还可能与非肿瘤疾病相关，包括免疫性疾病和神经性疾病［24，62］。本研究结果显示：NUP43在肝细胞癌组织中的表达显著高于癌旁组织，NUP43低表达和NUP43高表达患者肿瘤长径、病理学分级、肝内转移比较，差异均有统计学意义。这提示NUP43高表达与肝细胞癌患者恶性临床病理特征相关。进一步的研究结果显示：性别、NUP43表达、TNM分期、病理学分级是肝细胞癌患者术后总生存率的独立影响因素。这提示NUP43高表达与肝细胞癌患者不良预后相关。体外细胞实验结果显示：过表达NUP43可显著促进肝癌HepG2和SK‑HEP‑1细胞增殖和迁移能力。已有研究结果显示：NUP43与肿瘤增殖相关信号通路的激活有关，如RAS、PI3K‑AKT‑mTOR通路等［63‑70］。这提示NUP43可作为肝细胞癌临床检测或治疗的靶点。综上，NUP43在肝细胞癌组织中的表达显著高于癌旁组织。性别、NUP43表达、TNM分期、病理学分级是肝细胞癌患者术后总生存率的独立影响因素。过表达NUP43可显著促进肝癌HepG2和SK⁃HEP‑1细胞的增殖和迁移能力。作者贡献声明 顾永鹏：实验操作，论文撰写；刘洁、朱贞宝：数据整理，统计学分析；吴迪：实验操作，经费管理；谢传明、张雷达：研究指导，论文修改，经费支持详见本刊官方网站 http://www.zhxhwk.com本文为《中华消化外科杂志》原创文章，版权归中华医学会所有。其他媒体、网站、公众号等如需转载本文，请联系本刊编辑委员会获得授权，并在文题下醒目位置注明“原文刊发于《中华消化外科杂志》，卷（期）：起止页码”。谢谢合作！
