Matters arising，2024-07-17，Nature communications，[IF 14.7]

DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-024-49903-9

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-49903-9

第一作者：YongmingWang¹

通讯作者：Yingfei Ma¹

主要单位：

¹ 中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所，定量工程生物学中科院重点实验室

Chibani等人使用了六种计算工具来验证HGAVD中假定的古菌病毒序列，结果显示其中许多序列是非病毒序列。这一结果并不令人意外。这些工具是基于公共数据集中已有的参考病毒基因组开发的，而人类肠道中古菌病毒的公开数据库资源极少，这意味着这些计算工具在识别新的古菌病毒序列方面存在局限性。特别是，大多数通过宏基因组测序数据组装的片段序列都比较短，并且这些序列中预测的蛋白质很少，或者缺乏与已知病毒相似的蛋白质。在Li等人的研究中，我们使用了五种计算工具对数据进行了验证，并已展示和讨论了结果。值得注意的是，这些计算工具的结果之间存在很大的差异（见补充图1）。我们应用了VirSorter（类别1，2，4-6）、VirFinder（score ≥ 0.9且p < 0.05）、VirSorter2和DeepVirFinder（score ≥ 0.9且p < 0.05）等工具对HGAVD中的序列进行分析，结果显示被分类为病毒序列的HGAVD序列总数增加到537个，但每种工具的预测结果差异很大（见补充图1）。我们还将这六种计算工具（VirSorter v1.0.3（类别1, 2）、VirSorter2 v2.2.3（得分≥0.9且至少匹配一个病毒标志基因）、VirFinder v1.1（score ≥ 0.9且p < 0.05）、DeepVirFinder v1.0（score ≥ 0.9且p < 0.05）、VIBRANT v1.2.1（中等或更高质量得分）、CheckV v0.6.0）应用于由Shen等人收集的肠道噬菌体分离物集合（GPIC）数据集中的序列，该数据集包含209种人类肠道细菌的噬菌体。结果显示，只有21%的噬菌体被VirSorter预测为病毒（见补充图2a；补充数据1）。根据未培养病毒的最低信息标准（MIUViG），13.4%的GPIC噬菌体的完整性水平低于50%（基于CheckV）（见补充图2a）。这些结果表明，当前软件工具的预测能力有限，难以识别真正的病毒。我们将这些计算工具应用于从NCBI核苷酸数据库（GenBank）下载的完整古菌病毒基因组（n = 216），结果显示有18个病毒基因组未被这些工具识别，约50%（n = 107）的基因组被CheckV标记为低质量或未确定（见补充图2b；补充数据2）。我们还观察到每种工具的结果之间存在显著差异。此外，我们将这些计算工具应用于从先前研究中下载的82个Smacoviridae序列。VirSorter、VirSorter2、VirFinder、DeepVirFinder和VIBRANT的检测率分别降至0%、66%、43%、20%和0%（补充数据3）。这表明这些工具在识别古菌病毒方面的局限性。

我们开发的用于识别古菌病毒标志基因的工作流程相当严格（请参见补充材料或原始文章）。通过对rRNA基因数据库（Silva rRNA数据库v.138和Greengenes数据库v13_8_99）进行全面筛选，我们在HGAVD数据库中找到了31个包含rRNA基因的序列，其中17个序列被各种病毒检测工具检测到含有前病毒序列片段，剩余的序列被分类为不确定病毒（补充数据4）。来自包含rRNA基因序列的预测前病毒序列片段可以在以下网址找到：https://doi.org/10.6084/m9.figshare.21152404.v5。

特别是，最大的片段Zhang_X_2015_NM_ERR589874.NODE_1_560083中有39个和75个基因（26个基因重叠）分别与古菌病毒标志基因和VOG数据库的成员（http://vogdb.org）匹配（补充数据5）。此外，该片段被来自UHGG古菌基因组的间隔序列（n = 8）靶向（补充数据6）。VirSorter（--virome）在片段Zhang_X_2015_NM_ERR589874.NODE_1_560083（分类为类别5）中检测到了一个前病毒序列，具体位置为341,464到450,048 bp（补充数据7）。

为了更好地促进未来研究人员的使用，我们在此利用包括VirSorter、VirSorter2、VirFinder、DeepVirFinder、VIBRANT、geNomad和ViralVerify在内的多种生物信息学工具，将HGAVD序列分为五个不同的置信水平。通过结合这些工具的结果，我们将病毒的可信度分为五个不同的等级。这种分层将指导未来的研究人员根据他们的特定研究需求，选择具有适当置信水平的序列。分类的具体标准如下所述：完整病毒满足后续的高置信度病毒识别标准，并被CheckV确认为完整基因组。根据这些标准，HGAVD数据库中的33个序列被识别为完整的Caudoviricetes病毒，3个序列被识别为完整的smacoviruses，具体内容详见补充数据7。在Li等人的文章中，我们选择了这33个完整的Caudoviricetes病毒基因组进行进一步分析，如原文补充图13所示。

高置信度病毒是通过保守且可靠的方法识别的。它们是通过包括VirSorter（类别1、2、4、5）在内的工具检测到的，这些工具在Rahlff等人的研究中有引用，VirSorter2（--minscore 0.9）、VirFinder（score ≥ 0.9且p < 0.05）、DeepVirFinder（score ≥ 0.9且p < 0.05）、VIBRANT、geNomad（使用--conservative标志）和ViralVerify（分类为病毒）。满足超过两个这些软件工具标准的情况表明置信度较高，这可归因于保守的参数设置。利用这一分类标准，HGAVD数据库中的293个序列被归类为高置信度病毒（补充数据7）。

中等置信度病毒是通过结合使用多种软件工具识别的。这一分类涉及使用包括VirSorter（分类为cat3、cat6、circular）、VirSorter2（--min-score 0.5）、VirFinder（0.9 > score ≥ 0.7且p < 0.05）、DeepVirFinder（0.9 > score ≥ 0.7且p < 0.05）、geNomad（使用--relaxed标志）和ViralVerify（分类为不确定病毒）的工具。满足两个或两个以上这些工具检测阈值的序列被认为具有中等置信度。在高置信度病毒识别标准中仅满足单一软件标准的序列也被认为具有中等置信度。

低置信度病毒仅满足中等置信度病毒识别标准中的单一软件标准。

不确定病毒类别涵盖了不符合上述任何生物信息学软件工具识别参数的病毒序列。

最后，我们将HGAVD序列分为36个完整病毒、293个高置信度病毒、243个中等置信度病毒、390个低置信度病毒和317个不确定病毒（补充数据7）。包含五个不同置信度等级的古菌病毒序列和含rRNA基因序列的预测前病毒序列片段可以在以下网址找到：https://doi.org/10.6084/m9.figshare.21152404.v5。为了准确评估HGAVD数据库在“完整病毒”、“高置信度病毒”和“中等置信度病毒”类别中引入的新颖性比例，我们修改了原文图1d以创建图1。在图1中，I和II部分中的彩色节点代表“完整、高置信度和中等置信度病毒”。这种修改使我们能够直观地展示HGAVD数据库在增强古菌病毒检测和分类方面的新贡献。

Wang, Y., Li, R. & Ma, Y. Reply to: Inaccurate viral prediction leads to overestimated diversity of the archaeal virome in the human gut. Nat Commun15, 5977 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-49903-9