iMetaOmics | 南京农大朱伟云组-外周血清素在结肠稳态中的作用

综合组学揭示了LP533401抑制外周血清素合成后结肠微环境发生改变

●  LP533401显著抑制了新生大鼠肠道5-羟色胺（5-HT）的产生，通过增加隐窝深度和减少肠肌厚度来改变结肠形态；

● 早期抑制外周5-HT合成会改变结肠微生物功能，例如双组分系统和酪氨酸代谢，但不影响微生物组成；

●  干细胞过度增殖和Wnt信号通路的活化与5-HT水平相关。

引  言

5-羟色胺（5-HT）又称血清素，是一种影响肠道运动和大脑功能的主要神经递质。大部分5-HT在胃肠道（尤其是近端结肠）内的肠嗜铬细胞（ECs）中产生，而一小部分（~5%）5-HT在中枢神经系统中合成。色氨酸羟化酶（Tph）1和Tph2促进5-HT的合成。Tph1依赖的5-HT合成与宿主色氨酸代谢紧密相关，并受肠道微生物群的调控。先前的研究已证明，肠道微生物可以通过Lactobacillusamylovorus产生的乙酸盐来调节5-HT的产生。研究发现，5-HT信号通路的改变会影响肠道功能，包括蠕动和分泌，主要通过激活神经纤维和肠道神经元上的5-HT受体来实现。例如，敲除小鼠中的5-羟色胺受体4会影响肠道神经元的发育和存活，并促进新肠道神经元的产生。肠道干细胞的更新也受5-HT的调控。据报道，5-HT可促进肠道干细胞和结直肠癌细胞的增殖。在胚胎中，5-HT参与控制血清素能神经元出现之前的发育阶段的形态发生。Tph1敲除的新生小鼠在肺泡和心血管发育方面表现出明显的功能障碍，表明5-HT在发育中起着不可或缺的作用。

肠道微环境失调是导致疾病和肠道发育的主要原因。肠道上皮的高周转率和不断更新依赖于细胞内信号，包括Wnt和Notch配体。此外，肠道神经系统的终末分化受肠道微环境的影响，而肠道微环境也受5-HT的调节。此外，肠道微生物群可以通过肠道5-HT网络调节肠道神经系统的成熟。然而，5-HT对早期结肠微环境的综合影响及其与肠道微生物的相互作用仍不清楚。

外周5-HT合成，特别是在肠道中，与胃肠道症状、类癌瘤（类癌综合征）、肥胖和炎症有关。了解抑制外周5-HT合成的影响可能为治疗这些疾病提供新的途径。新生儿期是肠道发育和肠神经系统5-HT生成的关键时期。本研究旨在确定5-HT合成异常是否会影响肠道稳态，这对于了解肠道来源的5-HT的生理意义至关重要。我们假设肠道来源的5-HT失调会影响早期结肠微环境。通过使用LP533401抑制新生大鼠肠道来源的5-HT合成，本研究通过评估肠道形态、肠道微生物组和宿主功能来评估结肠微环境。多组学策略已被广泛用于了解体内宿主-微生物组相互作用，例如成年大鼠结肠微环境中的相互作用。为了研究新生大鼠的肠道微生物组和发育概况，我们采用了综合组学方法，包括宏基因组学、上皮转录组学和代谢组学。结果表明，生命早期外周5-HT合成受到抑制会扰乱结肠微环境。

结  果

LP533401灌胃改变了宿主的色氨酸-5-HT代谢为了阻断生命早期外周色氨酸-5-HT合成，将18只新生大鼠随机分为三组：空白对照组(NAÏVE，n=6)、对照灌胃组(CON，n=6)和LP533401灌胃组(LP，n=6)（图1A）。LP533401是一种外周5-HT合成抑制剂，用于降低外周5-HT水平。其原理是扰乱TPH1催化位点的Tyr235和Phe241（图S1），从而调节Tph1蛋白活性。在本研究中，NAIVE组和CON组之间的结肠5-HT浓度没有显着差异（p > 0.05）（图1B）。然而，与NAIVE组和CON组相比，LP533401给药显著降低了结肠5-HT浓度（p < 0.05）（图1B）。结肠组织的免疫荧光分析进一步证实了LP组5-HT蛋白信号降低（p < 0.05）（图1C）。此外，在LP组中观察到TPH1荧光强度呈下降趋势（p = 0.06）（图1D），吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO1）的荧光强度显着下降（p < 0.05）（图1E）。综上所述，这些结果验证了LP533401灌胃后结肠5-HT的抑制。

图1. LP533401对新生大鼠结肠色氨酸-5-HT合成代谢的影响

（A）实验设计包含空白对照（NAÏVE）、对照灌胃（CON）和LP533401灌胃（LP）大鼠组。（B）结肠组织中的5-HT浓度。（C）结肠切片中5-HT的免疫荧光成像。（D）结肠切片中TPH1的免疫荧光成像。（E）结肠切片中IDO1的免疫荧光成像。左图：代表性图像（比例尺=100μm）。右图：平均荧光强度的量化。数据显示为平均值±SEM，n = 6，ns表示p > 0.05，*p < 0.05，**p < 0.01。5-HT，5-羟色胺；TPH1，色氨酸羟化酶1；IDO1，吲哚胺2,3-双加氧酶1。

抑制外周5-HT影响结肠表型

基于肠道5-HT合成被抑制的前提，我们研究了新生大鼠的结肠形态。结果表明各组结肠长度无显著差异（p > 0.05）（图2A）。与NAÏVE和CON组相比，LP组的肠肌厚度减少（p < 0.05），结肠隐窝深度增加（图2B、C）。这些结果表明LP533401灌胃后结肠环境形态损伤（图2D）。此外，5-HT浓度与肠肌厚度呈正相关，与隐窝深度呈负相关（p < 0.05，|rho| > 0.7；图2E）

图2. 结肠表型及其与5-HT的相关性

对照灌胃（CON）组和LP533401灌胃（LP）组大鼠的结肠长度。（B）结肠肌间厚度的定量分析。（C）结肠隐窝深度的定量分析。（D）结肠代表性组织学显微照片（比例尺=100μm）。（E）结肠表型与5-HT浓度之间的相关性分析。星号表示Spearman相关系数的显著性，并描述rho值的准确性。数据以平均值±SEM表示，n = 6，ns表示 p > 0.05，*p < 0.05，**p < 0.01。5-HT，5-羟色胺。

5-HT抑制对微生物功能影响轻微

为了探索5-HT抑制对微生物组的影响，我们通过宏基因组测序分析了结肠内容物中的微生物组成和功能。Shannon指数和Simpson指数均保持不变（p > 0.05），表明LP干预后微生物丰富度和均匀度保持稳定（图3A）。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）分析表明，CON组和LP组之间的微生物群落结构无显著差异（p > 0.05）（图3B）。相对丰度TOP20属没有出现显著性差异，包括Lactobacillus、Streptococcus和Bacillus（图3C）。为了进一步研究5-HT抑制对微生物功能的影响，我们分析了富集的KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）途径。基于整体微生物功能read的PCoA显示各组之间没有差异（p > 0.05）（图3D）。在微生物功能层面，LP组双组分系统（ko02020）和酪氨酸代谢（ko00350）途径的相对丰度高于（p < 0.05）CON组（图3E）。总之，结肠微生物组成不受影响，但特定功能因外周5-HT抑制而改变。

图3. 结肠内容物中微生物组成和功能的宏基因组学分析

（A）对照（CON）和LP533401灌胃（LP）大鼠组结肠微生物组的Shannon和Simpson指数。（B）CON组和LP组之间微生物分类的PCoA分析。（C）结肠中前20个微生物属的相对丰度。（D）CON组和LP组之间微生物KEGG通路的PCoA分析。（E）富集的微生物KEGG通路的相对丰度。数据以平均值±SEM表示，n = 6，ns 表示p > 0.05，*p < 0.05。PCoA，主坐标分析。

转录组分析显示上皮功能改变

除了探究对结肠微生物的影响外，我们还通过转录组测序进一步研究了结肠上皮功能的变化。如火山图（图4A）所示，在p-adjus t≤ 0.05和|log₂Fold Change(FC)|≥2的标准下，LP533401灌胃后结肠组织中共有874个基因下调，1426个基因上调（图4A）。LP组具有更高的相对基因表达，例如fatty acid binding protein 1(Fabp1)、solute carrier family 9 member A3(Slc9a3)、cadherin related family member 1(Chdr1)和claudin3(Cldn3)（图4B）。进一步使用实时定量PCR（qPCR）验证转录组测序的结果，包括色氨酸代谢酶和参与干细胞信号传导的基因的表达（图S2）。差异基因分析的通路富集显示了一个以神经病学为导向的三角关系，包括Alzheimer's disease、Neurodegeneration-multiple disease和Spinocerebellar ataxia（图4C）。LP533401灌胃后，与病原体感染反应信号传导（例如Salmonella和Yersinia感染）和癌症信号传导（small cell lung cancer、proteoglycans in cancer和pancreatic cancer）相关的宿主代谢通路发生了改变（图4C）。此外，与肠道发育相关的关键通路，包括Wnt信号通路和Hippo信号通路，也得到了富集（图4C）。这些结果表明，肠道合成的5-HT的抑制会在转录水平上影响结肠上皮功能。

与细胞增殖和分化相关的标记基因发生改变

为了研究与细胞增殖和分化相关的肠道形态异常的可能机制，分析了转录组数据集中不同细胞类型的标记基因表达（图4D）。LP组中，干细胞标记物olfactomedin 4（Olfm4）的表达上调；吸收细胞标记物keratin 20（Krt20）的表达在 LP 组中也升高；分泌谱系包括杯状细胞、丛状细胞和肠内分泌细胞；杯状细胞的标记基因mucin 2（Muc2）和丛状细胞的标记基因pou class 2 homeobox 3（Pou2f3）上调（图4D）。使用qPCR分析进一步验证了这些结果。LP组Olfm4和achaete-scute complex homolog 2（Ascl2）mRNA表达low-density lipoprotein receptor-related protein 5（Lrp5）和Wnt，增加（p < 0.05；图4E）。Wnt信号通路相关基因的表达，包括在LP组中也升高（p < 0.05；图4F）。免疫荧光染色在细胞水平上进一步验证了ASCLl2和WNT3的表达（p < 0.05；图4G）。综上所述，这些结果表明，抑制外周5-HT合成可能导致与肠道干细胞增殖和Wnt通路信号传导相关的标志基因发生变化。

图4. 结肠粘膜转录组分析和与细胞增殖相关的标志基因的mRNA表达

（A）对照组（CON）和LP533401灌胃（LP）大鼠组之间的差异基因火山图。（B）热图中排名前30的差异基因。（C）差异基因富集转录组通路相关性网络图。（D）与细胞增殖和分化相关的标志基因的丰度。（E）结肠组织中Lgr5、Ascl2和Olfm4的相对mRNA表达。（F）结肠组织中Lrp5和Wnt3的相对mRNA表达。（G）结肠中ASCL2和WNT3蛋白的免疫荧光染色。左图：代表性图像（比例尺=100μm）。右图：平均荧光强度的量化。数据以平均值±SEM显示，n = 6，ns表示p > 0.05，*p < 0.05，↑表示上调，↓表示下调。Lgr5, leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5; ASCL2/Ascl2, achaete-scute complex homolog 2；Olfm4，olfactomedin 4；Krt20， keratin 20；Aldob， aldolase B；Muc2， mucin 2；Tff3， trefoil factor 3；Sox9， SRY-box transcription factor 9；Pou2f3， POU class 2 homeobox 3；Chga， chromogranin A；Neurod1， neurogenic differentiation 1；Lrp5， low-density lipoprotein receptor-related protein 5

代谢组学分析揭示关键代谢物与结肠表型相关

结肠粘膜代谢组共鉴定出474种代谢物（图5A）。这些代谢物属于八种主要代谢途径，包括氨基酸和肽、碳水化合物、辅因子和维生素、能量、脂质、核苷酸和外来生物。正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）显示CON和LP组之间的代谢组结构不同（图5B）。在p < 0.05和变量重要性投影（VIP） > 1.5时共鉴定出25种不同的代谢物。其中，23种呈现下调趋势，包括5-HT、泛酸、胞嘧啶、乳清苷酸、抗坏血酸和3'-腺苷单磷酸（图5C）。此外，琥珀酸和前列腺素E1也上调（图5C）。代谢物途径富集分析显示核苷酸代谢、信号转导以及辅因子和维生素代谢发生了改变（图5D）。此外，建立了鉴别代谢物与肠道表型指数之间的相关性，以反映5-HT抑制后的潜在机制。值得注意的是，抗坏血酸、泛酸、核黄素、鸟嘌呤和乳清苷酸与结肠中的5-HT 浓度和肠肌厚度呈正相关，琥珀酸与肠肌厚度呈负相关（图5E）。此外，抗坏血酸与隐窝深度呈负相关，而前列腺素 E1 与结肠隐窝深度呈正相关（p < 0.05，|rho| > 0.7）（图5E）。

为了阐明关键代谢物在转录水平上受到调控的潜在机制，整合了转录组学和代谢组学的数据（图6A）。其中，鸟嘌呤脱氨酶（Gda）与5-HT、泛酸和胞苷3'-单磷酸（CMP）呈负相关（p < 0.05，|rho| > 0.7）腺苷酸脱氨酶 (Ampd) 与 5‐HT 和鸟苷酸 (GMP) 呈负相关。（p < 0.05，|rho| > 0.7）（图6B）。

图5. 结肠黏膜代谢组学分析及与5-HT的相关性

（A）474种代谢物的分类。（B）CON组与LP组代谢组的正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）分析。（C）组间判别代谢物的火山图。代谢物标签的配色方案与图A中的八个类别一致。（D）判别代谢物的富集途径。（E）结肠表型与判别代谢物的相关性分析。星号表示Spearman相关系数的显著性，描述rho值的准确性。右侧条形颜色与代谢物的八个类别一致。

图6. 代谢组和转录组数据集的整合

（A）代谢过程簇中鉴别代谢物和相关转录组基因的图谱。箭头表示代谢物含量的变化：↑表示上调，↓表示下调。（B）基因与代谢物之间的相关性分析。星号表示Spearman相关系数的重要性，描述了rho值的准确性。Tph1, tryptophan hydroxylase1; ALDH, aldehyde dehydrogenase; GULO, L-gulonolactone oxidase; PANK, pantothenate kinase; NT5E, 5'-nucleotidase; PNP, purine nucleoside phosphorylase; GDA, guanine deaminase; CDA, cytidine deaminase; XDH, xanthine dehydrogenase; UMPS, uridine monophosphate synthetase; ADA, adenosine deaminase; AMPD, AMP deaminase。

讨  论

本研究旨在阐明肠道来源的5-HT在新生大鼠结肠微环境和肠道微生物群中的调节作用。这些结果表明，抑制肠道来源的5-HT合成对肠道形态和代谢的各个方面有显著影响。

肠道微生物群与5-HT之间的相互作用因其在肠道功能中的关键作用而受到广泛关注。我们之前的研究证明，肠道微生物可以通过调节Tph1酶活性来影响宿主5-HT的产生。然而，宿主5-HT对肠道微生物群的影响仍然不明确。值得注意的是，据报道一些微生物也具有感知和运输5-HT的受体。先前对Tph1敲除小鼠的研究表明5-HT对肠道微生物群有潜在影响。然而，由于系统性敲除，导致微生物改变的致病因素可能比5-HT更复杂。在本研究中，通过LP533401靶向抑制肠道来源的5-HT，以避免基因敲除引起的其他表型变化。结果表明，早期抑制5-HT合成对第11天结肠微生物群影响甚微。与本研究结果相反，另一项研究表明，Tph1基因敲除会影响小鼠的生长和微生物组成。发现差异的原因可能是11日龄新生大鼠的微生物群尚不成熟且不太复杂，无法观察到显著影响，这有待在未来的研究中进一步探讨。

值得注意的是，尽管微生物组成没有发生显著改变，但LP533401灌胃法影响了微生物功能。双组分系统（ko02020）和酪氨酸代谢（ko00350）的微生物途径被上调。据报道，双组分系统的表达在炎症性肠病中上调，表明与肠道健康呈负相关。此外，该途径是肠道微生物感知和应对环境变化的基本机制，表明微生物对5-HT缺乏的反应，这可以促进肠道健康。一项早期研究可能支持这一假设，该研究表明特定微生物可以感知周围5-HT的变化。

另一个发现是微生物酪氨酸代谢的改变。酪氨酸和色氨酸代谢是调节神经递质合成的关键过程。它们共享共同的酶芳香族L-氨基酸脱羧酶，该酶分别将L-DOPA转化为多巴胺和将5-HTP（5-羟色氨酸）转化为5-HT。早期的一项研究证明，在(+)-3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺诱导的5-HT耗竭期间，将L-酪氨酸局部输注到纹状体或海马中会通过降低5-HT来加重功能障碍，这表明酪氨酸和5-HT合成之间存在代谢串扰。酪氨酸和色氨酸可被肠道微生物利用来产生次级代谢产物。然而，微生物酪氨酸代谢的改变是否会影响宿主代谢仍有待进一步探讨。

5-HT对结肠干细胞增殖和分化的影响是本研究的另一个兴趣点。先前的研究表明，肠道血清素能神经元产生的5-HT可通过Wnt/β-catenin信号传导促进干细胞自我更新。在这里，我们观察到抑制外周5-HT产生会增加干细胞的标志基因表达，这表明5-HT、干细胞和Wnt信号通路之间可能存在潜在关系。5-HT受体广泛表达于干细胞和其他细胞类型中，以调节增殖和分化。例如，结直肠癌干细胞中的5-HT^21B/1D/1F受体可参与Wnt/β-catenin信号传导。杯状细胞上5-HT4受体的激活可促进Muc2表达并改善结肠屏障功能。在本研究中，LP533401干预导致吸收（例如肠细胞）和分泌（例如杯状细胞和丛状细胞）谱系细胞的标记基因表达增加，揭示了由于5-HT缺乏导致的结肠微环境改变。

此外，不同肠道细胞类型的这些变化可能与肠道形态学变化有关。有报道称，5-HT2A受体的敲除导致肌肉层变薄。同样，本研究显示LP533401干预后肌层厚度降低。研究发现，位于隐窝底部的Wnt信号有助于维持干细胞增殖并防止分化。在本研究中，Wnt3和Lrp5表达增加表明结肠中Wnt信号增强。Ascl2表达增加表明促进了干细胞增殖。然而，异常的Wnt信号激活可导致细胞过度增殖和肿瘤形成。因此，这些病变中的隐窝深度可能增加，反映了本研究中细胞增殖活性异常。总体而言，抑制肠道来源的5-HT可能影响各种类型细胞的增殖和分化，从而影响肠道形态。

5-HT是一种神经内分泌肽，在肠道炎症中起着关键作用。释放的5-HT可激活树突状细胞上的5-HT7受体，引发促炎级联反应。此外，5-HT还可以通过5-HT4受体在肠粘膜中发挥抗炎作用。在本研究中，隐窝深度增加和肠壁变薄表明肠道发生了严重的炎症和组织损伤。据报道，IDO1介导的通路在体内表现出促炎作用，而IDO1抑制可能会减轻慢性炎症造成的损害。然而，我们的结果显示IDO1 mRNA和蛋白质表达显着下降。据报道，Tph1介导的色氨酸代谢和IDO1介导的色氨酸代谢之间存在竞争关系，这表明5-HT干预可能通过负反馈调节抑制IDO1表达。

此外，本研究还表明，抑制5-HT后，病原体感染途径（包括Salmonella感染、Yersinia菌感染和乙型肝炎）增多，这些途径已知通过破坏肠道菌群和激活免疫反应的机制引发严重的肠道炎症。本研究中鸟嘌呤的下调可能支持这一假设，因为据报道，鸟嘌呤与感染性腹泻和结肠炎有关，并影响调节Toll样受体9的配体的形成。在代谢物水平上，琥珀酸增加和抗坏血酸减少也可能提供肠道炎症反应的证据。琥珀酸可以增强炎症并在宿主的能量稳态中发挥重要作用，调节肠道微生物的组成。抗坏血酸是炎症的关键因素，可以减少氧化应激和免疫细胞功能。克罗恩病患者有抗坏血酸缺乏的风险，抗坏血酸会通过改变微生物组成而导致炎症性肠病的发病机制。此外，在本研究中，泛酸显示出减少。泛酸可以通过抑制JNK/P38MAPK信号通路来帮助缓解炎症。这些发现表明，外周5-HT合成的抑制容易引起促炎反应，但在未来研究中需要更多证据来提供深入而全面的解释。

为了进一步解释5-HT抑制改变肠道发育的内在原因和机制，进行了5-HT、代谢物和表型之间的相关性分析。在本研究中，抗坏血酸、泛酸、核黄素、鸟嘌呤和乳清苷酸与结肠肠肌厚度呈正相关，前提是它们与5-HT浓度呈正相关。与目前的发现一致，据报道鸟嘌呤参与了5-HT信号转导过程，这可能与观察到的肠道表型改变有关。据报道，肠肌厚度与食糜通过率和营养消化率有关。在慢性肠道炎症中发现肠壁变薄，尤其是在克罗恩病或溃疡性结肠炎中，并且与某些关键营养素（如维生素）的缺乏有关。抗坏血酸（维生素C）减少可能会削弱肠道屏障，导致肠壁通透性增加，从而引发结构损伤和肠壁变薄。同样，泛酸等维生素不足可能会损害肠道完整性，而泛酸补充过量则会逆转这一过程，这为本研究观察到的肠道形态不良提供了一种潜在机制。

该研究由于在新生儿中进行动物重复实验，并且选择在研究结束时仅测试一个时间点受到限制。LP533401可能对结肠功能产生动态调节作用。这将通过未来的纵向研究得到解决。早期干预是否具有长期影响仍不得而知。因此，未来进行更多重复实验和更多时间点的研究将有助于探索5-HT如何调节体内肠道微环境。

结  论

LP533401抑制外周5-HT合成对新生大鼠模型中的结肠微环境产生了显著影响。结肠组织学发生了变化，表现为隐窝深度增加和肠肌厚度减少。宏基因组学分析显示微生物功能略有改变，但微生物组成没有显著改变。与细胞增殖和Wnt通路相关的标记基因（例如Ascl2和Wnt3）上调，反映了LP533401干预后隐窝深度的增加。代谢物（例如抗坏血酸）与5-HT浓度和隐窝深度之间的相关性可能进一步解释结肠中复杂的相互作用。总之，我们的结果表明抑制肠道来源的5-HT可能会使结肠微环境向不利方向改变，这拓展了我们对5-HT在结肠微环境中的调节作用的理解。

方  法

动物样本采集

所有动物操作均经南京农业大学和大学实验动物福利与伦理委员会批准（批准号：NJAU.No20220701141）。

8周龄Sprague Dawley大鼠（体重约400g）来自Vital River（北京，中国）。大鼠被饲养在塑料笼中，笼内条件恒定（温度22˚C；湿度62%），光照周期为12小时。适应1周后，按照繁殖方案将雄性和雌性配对。共获得18只幼崽，并随机分配到空白对照组（NAÏVE，n = 6）、对照组（CON，n = 6）和LP533401灌胃组（LP，n = 6）。所有幼崽均由其自然母亲哺乳。从4日龄开始，每隔一天上午8:00记录体重，然后口服灌胃LP533401或等体积的溶剂。将LP-533401（MedChemExpress，美国）以40：60（v/v）的比例溶解在PEG200：5％葡萄糖溶液中，以制备2mg/ml工作溶液。根据先前的研究，选择30mg/kg的剂量。幼崽不接受任何治疗。大鼠在出生后第11天通过断头处死。样本量的选择是为了尽量减少新生大鼠的使用并平衡统计学效力。

切下约1cm的中段结肠段并在室温下用4％多聚甲醛保存在试管中。垂直切开剩余的结肠段以分别获得结肠消化物和结肠组织。样本在液氮中速冻，并储存在-80˚C下，直至进一步分析。进行实验室分析的人员对研究的分组信息一无所知。

5-HT水平测定

用预冷的PBS（0.01 M，pH=7.4）冲洗结肠组织以去除残留血液，称重后将组织切碎。将切碎的组织加入体积比1：9的PBS和少量2 mm锆珠。为进一步裂解组织细胞，用细胞破碎仪研磨组织样本。匀浆液以5000×g离心5分钟，收集上清液。用ELISA试剂盒（MALLBIO，中国）检测5-HT浓度。

组织学和免疫荧光染色

室温下用4%多聚甲醛固定肠道样本。将组织块在梯度酒精系列和二甲苯中逐渐脱水以取代组织中的酒精。将半透明的组织块嵌入石蜡块中，切成5微米厚的切片，并贴在玻璃载玻片上。对于组织学，切片用苏木精-伊红（HE）染色。在光学显微镜下观察和拍照。用Image-ProPlus6.0测量结肠的隐窝深度和肌间厚度。

对于免疫荧光染色，将组织切片脱蜡并用二甲苯和递减乙醇梯度重新水化。然后修复组织抗原（在10mM柠檬酸钠、pH6.0溶液中99℃20分钟），然后在5%牛血清白蛋白（BSA）中在室温下封闭1小时。将切片与一抗在4℃下孵育过夜。为避免非特异性信号，用PBS清洗切片5分钟，3次。在室温下应用二抗1小时。使用以下抗体：兔抗5-HT抗体1:200（Bioss，北京，中国），兔抗Tph1抗体1:200（CellSignaling，中国），小鼠抗IDO1抗体1:200（Proteintech，中国），小鼠抗ASCL2抗体1:200（Proteintech，中国），小鼠抗Wnt3抗体1:200（Proteintech，中国），FITC-山羊抗小鼠lgG（H+L）1:200（Elabscience，中国）。4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)用于细胞核中的DNA荧光染色。所有切片图像均在LeicaMicrosystemsCMSGmbH（徕卡显微系统，中国）上拍摄，并采用Image-ProPlus6.0分析5-HT、Tph1、IDO1、Ascl2和Wnt3的平均荧光强度。

宏基因组测序

使用E.Z.N.A.®粪便DNA 试剂盒（Omega Bio-Tek，美国）提取结肠消化物样本中的粪便基因组 DNA。使用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测提取的粪便基因组DNA的质量。使用Covaris S220聚焦超声波仪（Woburn，MAUSA）从每个样本中剪切1μg基因组 DNA。然后根据制造商的说明（Biozeron，中国）构建DNA文库。所有样本均在Illumina HiSeq X仪器上以双端150bp模式进行测序。为了去除衔接子污染物和低质量读段，对这些原始序列读段使用了Trimmomatic（参数：ILLUMINACLIP：adapters. fa:2:30:10 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:75，http://www.usadellab.org/cms/uploads/supplementary/Trimmomatic）。通过BWA mem 算法（参数：-M -k 32 -t 16，http://bio-bwa.sourceforge.net/bwa.shtml）将质量控制的读段映射到大鼠基因组（mRatBN7.2/rn7）。在最后一步中，对干净的读段进行过滤和修剪，以避免宿主基因组污染和低质量数据，然后将其用于进一步分析。基于定制的Kraken数据库确定干净读取的分类法，该数据库包含NCBI RefSeq数据库中所有细菌、古菌、真菌、病毒、原生动物和藻类基因组序列。通过Bracken（https://ccb.jhu.edu/software/bracken/）估计分类法的丰度。在MegaHit的帮助下，使用“--min-contig-len 500”参数从干净序列读取中获取一组重叠群。使用Prodigal（v2.6.3）预测组装重叠群的开放阅读框（ORF）。然后，从使用CD-HIT聚类后的ORF中获得一组独特基因（参数：-n 9 -c 0.95 -G 0 -M 0 -d 0 -aS 0.9 -r 1）。每个簇的最长序列被视为独特基因集中每个基因的代表序列，并使用salmon软件计算基因丰度。使用BLASTX对蛋白进行功能及注释，并根据KEGG数据库中特有的基因集对结果进行注释；根据结肠食糜样本的KO结果，利用KEGG Pathway数据库，通过基因映射的通路注释，确定每个样本的具体功能和通路。

RNA提取及实时定量PCR

从结肠组织中提取总RNA的方法如下。将组织样本浸泡在冷的Trizol中，然后用锆珠研磨机研磨成悬浮液。悬浮液在4°C下以12,000×g离心5分钟，除去上清液。将1/5体积的氯仿加入到上清液中，剧烈振荡15秒以制成乳状液。将乳状液在4°C下以12,000×g离心15分钟，将上层水相液体移至另一管中。然后，加入等体积的预冷异丙醇并与液体混合。将液体在4°C下以12,000×g离心10分钟。离心后，弃去上层液体，保留底部沉淀。加入 1 ml 75%乙醇（用无RNase的双蒸水制备）以悬浮沉淀。然后在4°C下以12,000 × g离心乙醇5分钟。将沉淀的RNA干燥5分钟，然后溶解在无RNase的水中以测试纯度、浓度和完整性。

所有cDNA均使用HiScript III RT SuperMix（Vazyme，中国南京）从RNA合成。使用ChamQ Universal SYBR Green qPCR Master Mix（Vazyme，中国南京）在Applied Biosystems QuantStudio 5 PCR 系统（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州）上运行进行RT-PCR。使用ΔΔCT方法计算倍数变化。将mRNA 表达标准化为作为内部参考基因的β-actin表达，计算方法基于宝贵的研究。所有引物序列列于表S1中。

非靶向代谢组学

样品送至PANOMIX（苏州，中国）进行代谢组学检测。将结肠组织样品和钢珠浸没在组织提取溶液中，在4℃下以12,000×g离心10分钟。提取上清液进行LC-MS检测。使用Thermo Vanquish（美国赛默飞世尔科技）超高效液相系统和ACQUITY UPLC® HSS T3 T3（2.1×150 mm，1.8 µm）（Waters，美国马萨诸塞州米尔福德）色谱柱进行LC分析。使用带有ESI离子源的Orbitrap Exploris 120（美国赛默飞世尔科技）对代谢物进行质谱检测。使用同时MS1和MS/MS（全MS-ddMS2模式，数据依赖型MS/MS）采集。

首先通过ProteoWizard软件包(v3.0.8789)中的MSConvert将原始数据转换为 mzXML 格式，然后使用 XCMS进行处理以进行特征检测、保留时间校正和对齐。通过精确质量（< 30 ppm）和MS/MS数据鉴定代谢物，并与HMDB（http://www.hmdb.ca）、massbank（http://www.massbank.jp/）、LipidMaps（http://www.lipidmaps.org）、mzcloud（https://www.mzcloud.org）和KEGG匹配。采用稳健LOESS信号校正（QC-RLSC）进行数据归一化，以纠正任何系统偏差。归一化后，仅保留QC中相对标准偏差（RSD）小于30%的离子峰，以确保正确鉴定代谢物。使用MetaboAnalyst对差异代谢物进行通路分析，该软件将强大的通路富集分析结果与通路拓扑分析相结合。然后将代谢组学中鉴定的代谢物映射到KEGG通路，以便对更高级的系统功能进行生物学解释。使用KEGG Mapper 工具可视化代谢物和相应的通路。使用MetaboAnalyst 4.0（https://www.metaboanalyst.ca/）分析代谢通路。

转录组测序

根据“RNA提取和实时定量PCR”部分中的详细信息，使用TRIzol®试剂（Invitrogen）提取结肠组织的总RNA。使用DNase I（Takara）去除基因组DNA。然后使用2100 Bioanalyser（Agilent）确定RNA质量，并使用ND-2000（NanoDrop Technologies）进行定量。使用高质量RNA样本（OD260/280 = 1.8~2.2、OD260/230 ≥ 2.0、RIN ≥ 6.5、28S:18S ≥ 1.0、> 10μg）构建测序文库。

使用Illumina（加利福尼亚州圣地亚哥）的TruSeqTM RNA样本制备试剂盒，使用1 μg总RNA制备RNA-seq转录组文库。信使RNA用寡核苷酸珠子分离，经polyA选择后，使用片段化缓冲液进行片段化。所有cDNA合成、末端修复、A碱基添加和Illumina索引接头的连接均按照Illumina的方案进行。

然后在2% Low Range Ultra Agarose上对文库进行大小选择，以获得 200–300 bp的cDNA靶片段，并使用Phusion DNA聚合酶进行PCR 扩增，进行 15个PCR循环。双端文库通过Illumina NovaSeq 6000测序仪进行测序（150 bp*2，上海BIOZERON有限公司）。使用具有参数（SLIDINGWINDOW: 4: 15 MINLEN: 75）的trimmomatic（版本0.36 http://www.usadellab.org/cms/uploads/supplementary/Trimmomatic）对原始双端读段进行修剪和质量控制，然后使用hisat2（https://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml）软件将干净的读段分别与参考基因组进行定向比对。该软件用于使用默认参数进行映射。使用qualimap_v2.2.1（http://qualimap.bioinfo.cipf.es/）进行数据质量评估。使用htseq（https://htseq.readthedocs.io/en/release_0.11.1/）对基因读段进行计数。

统计和可视化

功效计算表明，每个治疗组 5 只大鼠的样本量可以检测到效应大小D为2.54，功效为95%，使用G*Power 3.1.9.7进行单尾t检验的I型误差为5%。所有数据均通过R4.3.1分析，并使用R 4.3.1、GraphPad Prism 9和OmicStudio工具进行可视化。

对于5-HT浓度和HE染色分析，使用单因素方差分析检测与Fisher LSD检验的多重比较的显着差异。对于免疫荧光和qPCR分析，使用学生t检验检测两组之间的显着差异。p < 0.05被认为具有统计学意义。对于微生物群数据，使用Wilcoxon符号秩检验检测两组之间的显着差异。p < 0.05被认为具有统计学意义。对于转录组学数据，使用edgeR在标准（p-adjust ≤ 0.05和|log2 FC| ≥ 2）下筛选组间统计学差异基因。对于代谢组学数据，使用OPLS-DA确定标准（p < 0.05 和VIP 值 > 1.5）下具有统计学差异的代谢物。采用Spearman方法计算相关性分析。p < 0.05 和|rho| > 0.7的值被认为具有显著相关性。

Tph1蛋白的氨基酸序列来自NCBI（NP_004170.1）。使用SWISS-MODEL网站建立蛋白质结构模型。在DeepView软件中标记特定氨基酸残基。

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“iMeta” 是由威立、肠菌分会和本领域数百千华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表所有领域高影响力的研究、方法和综述，重点关注微生物组、生物信息、大数据和多组学等。目标是发表前10%(IF > 20)的高影响力论文。期刊特色包括视频投稿、可重复分析、图片打磨、青年编委、前3年免出版费、50万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊发行！发行后相继被Google Scholar、ESCI、PubMed、DOAJ、Scopus等数据库收录！2024年6月获得首个影响因子23.7，位列全球SCI期刊前千分之五(107/21848)，微生物学科2/161，仅低于Nature Reviews，同学科研究类期刊全球第一，中国大陆11/514！

“iMetaOmics” 是“iMeta” 子刊，主编由中国科学院北京生命科学研究院赵方庆研究员和香港中文大学于君教授担任，是定位IF>10的高水平综合期刊，欢迎投稿！