通过微生物相互作用激活小麦激素途径抵御小麦黄花叶病毒侵染
2024年10月15日，宁波大学植物病毒研究所微生物生态与土壤健康组联合小麦病毒研究组在Microbiome在线发表题为“Combating wheat yellow mosaic virus through microbial interactions and hormone pathway modulations”的研究论文。揭示了小麦招募有益微生物在其根际定殖，激活小麦茉莉酸和水杨酸途径，进而抵御病毒侵染的机制，明确了根际微生物在抵御小麦土传病毒病中的关键作用。
Article，2024-10-15，Microbiome，[IF 13.8]
DOI：https://doi.org/10.1186/s40168-024-01911-z
原文链接：
https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-024-01911-z
第一作者：Fangyan Wang（汪方燕）
通讯作者：Tida Ge（葛体达）；Haoqing Zhang（张昊青）
主要单位：
宁波大学植物病毒研究所
农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室
悉尼大学霍克斯伯里环境研究所
华中农业大学资源与环境学院农业微生物学国家重点实验室
- 摘要 -
根际微生物是抵御土传病原体的第一道防线，识别并利用抵御病原侵染、保障植物健康的关键微生物可为土传病害防控提供新思路和新策略。然而，其在抵御土传病毒（例如由禾谷多黏菌（Polymyxa graminis）传播的小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic virus, WYMV）方面的作用还未被深入探讨。在这项研究中，作者假设在病毒感染期间，植物微生物组与植物进行关键的相互作用，其中关键微生物在维持植物健康方面发挥着至关重要的作用。本研究通过综合利用多种技术，如大规模样品采集、植物和土壤微生物组的高通量测序、微生物分离培养、室内水培实验和转录组测序，以识别具有抑病潜力的关键物种，同时，验证其抑病效果并解析其抑病机理。作者发现与根和叶相比，根际土壤中的细菌和真菌在预测小麦产量以及P. graminis和WYMV丰度方面更为显著。通过LEfSe分析结合随机森林模型作者发现健康小麦根际富集更多潜在有益的微生物，例如鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）和根瘤菌（Allorhizobium-Neorhizobium-Parararhizobium-Rhizobium），而患病小麦根际多为潜在病原体，例如Bipolaris和Fusicolla。结构方程模型表明，健康/发病小麦根际土壤微生物标志物可通过调节根际微生物组和禾谷多黏菌丰度直接或间接影响小麦产量。将两种关键的健康小麦根际微生物标志物（Sphingomonas azotifigens和Rhizobium deserti）接种至染毒/不染毒小麦根际后，发现在未染毒小麦中，二者可通过激活小麦生长素和细胞分裂素信号通路促进小麦生长，在染毒小麦中，二者可通过调节茉莉酸和水杨酸通路降低病毒侵染量。总的来说，该研究揭示了根际微生物组在抵御小麦土传病毒病中的重要作用，并强调了特定微生物在维持植物健康方面的潜力。
- 引言 -
各种土传疾病的爆发严重影响植物健康，导致多种作物的生产力降低。越来越多的证据表明，植物微生物组可通过直接抑制病原菌生长、与病原菌竞争养分以及与植物免疫系统相互作用等机制来维持作物健康。通过调节植物微生物多样性、群落组成和功能，将微生物组从“导病”转变为“抑病”状态可为土传病害的绿色防控提供新思路和新策略。因此，了解和识别保障植物健康的关键微生物类群非常重要。然而，尽管植物微生物组在对抗土传细菌、真菌和原生动物病原体方面已经有大量研究，但植物微生物组如何响应和影响RNA病毒引起的土传病害仍不清楚。
小麦黄花叶病是一种广泛分布的土传病毒病，主要由小麦黄花叶病毒（WYMV）引起，该病毒通过土壤中的原生生物禾谷多黏菌传播，近年来已在全球范围内大规模传播，导致小麦产量降低10-30%，严重时甚至会降低50-70%。目前通过选育抗病育种提高小麦对病毒的抗性是小麦黄花叶病防控的主要手段，但培育广谱持久抗性的品种仍具有挑战性。因此，通过调控植物或土壤微生物组抵御病原侵染，提高小麦对土传病毒WYMV的抗性被认为是一种替代方法，可实现土传病害的“源头”防控。作者在前期的研究中发现，小麦根际微生物群落及其组装过程响应小麦黄花叶病的发生，但是，是否存在直接或间接抑制病毒和禾谷多黏菌，从而维持小麦健康和产量的关键微生物仍有待研究。值得注意的是，WYMV的载体P. graminis是土壤传播的，而根际正是是病毒、禾谷多黏菌与植物建立寄生关系的主要场所。因此，根际微生物很可能通过与P. graminis相互作用进而影响小麦黄花叶病的发生。
根际微生物不仅可能通过与P. graminis直接相互作用抑制病毒的传播，也可能通过诱导小麦的系统抗性（ISR）帮助小麦抵御病毒侵染。基于上述概念，作者假设：（i）与小麦其他部分相比，如根、叶等，小麦根际微生物对小麦黄花叶病的响应更加强烈，在预测小麦黄花叶病发生和维持小麦产量方面发挥更重要的作用，（ii）患病小麦根际可能富集潜在致病微生物，进而促进WYMV侵染，（iii）定殖于健康根际的特定微生物可通过诱导小麦ISR以抵御WYMV侵染，从而维持植物健康。
为了检验这些假设，作者采集了来自中国山东、江苏和河南三个小麦黄花叶病高发区的健康/发病小麦样品及其根际土壤，解析了健康/患病小麦根际、根内和叶内的细菌、真菌和原生动物群落差异，同时，使用机器学习的手段确定了具有抑病潜能，同时维持小麦产量的关键微生物类群。最后，作者成功地从根际分离了这些关键微生物，验证了它们在促进植物生长和抵御病毒侵染过程中的作用，并通过转录组测序（RNA-seq）揭示了其抑病促生的分子机制。研究结果揭示了根际微生物组在防控土传病毒病中的重要作用，同时，强调了特定微生物在维持植物健康方面的潜力。
- 结果 -
植物微生物组与小麦产量、P. graminis和WYMV关联分析
Correlating the plant‑associated microbiome with wheat yield and the abundances of P. graminis and WYMV
小麦黄花叶病的田间症状如图2a所示。小麦黄花叶病发病造成位点1（山东莒南）减产15.8%～29.3%，位点2（江苏扬州）减产15.1%～19.6%，位点3（河南驻马店）减产43.1%～48.0%（图2b）。根际土壤中病毒载体P. graminis的丰度和小麦叶片中的WYMV载量随着植物患病程度的增加而增加。例如，在位点1，患病小麦根际的P. graminis丰度相比健康小麦根际增加101.5%~306.5%（图2c、d）。在健康小麦叶片中，WYMV 载量为0，而在中度和重度发病小麦体内则增加至1.63 × 104和1.28 × 106。在位点2，患病小麦根际的P. graminis丰度较健康小麦增加了43.8%~54.7%。随着发病程度的增加，WYMV载量从健康小麦体内的4.25 × 103增加至6.32 × 103（中度发病）和3.35 × 107（重度发病）。在位点3，患病小麦根际禾谷多黏菌丰度较健康小麦增加106.5%~287.0%，随着发病程度的增加，WYMV载量从健康小麦体内的7.67 × 103增加至1.61 × 106和6.75 × 106。同样，我们检测到小麦根际中的P. graminis丰度（R2 = 0.61，p < 0.001）和小麦叶片中的 WYMV 丰度（R2 = 0.41，p = 0.005）与小麦产量之间存在显著且强烈的负相关。这表明小麦黄花叶病引起的产量损失与叶片中较高的WYMV丰度和根际中较高的P. graminis丰度相关（图2e）。为了揭示小麦微生物组与病害发生的关联机制，我们研究了小麦产量、P. graminis、WYMV和小麦微生物组的相关性。我们发现，小麦根际微生物组对小麦产量、P. graminis和WYMV的预测性能优于根内和叶内微生物。这表明根际微生物组在响应小麦黄花叶病中起到重要作用（图2f-h，图S1-S3）。此外，相比于原生动物，细菌和真菌群落对小麦产量、P. graminis和WYMV的预测性能更优。
图2 不同发病程度小麦产量、根际P. graminis丰度、叶片WYMV丰度及其与植物相关微生物组的相关性。
(a) 小麦黄花叶病的田间表型；
(b) 山东莒南（位点1）、江苏扬州（位点2）和河南驻马店（位点3）不同发病程度的小麦产量；
(c) 不同发病程度小麦根际P. graminis丰度；
(d) 不同发病程度小麦叶片中的WYMV丰度；
(e) 小麦根际P. graminis丰度、叶片WYMV载量与小麦产量之间的相关性；
(f–h) 小麦根际、根内、叶内微生物组（细菌、真菌和原生动物）对于预测P. graminis丰度、WYMV载量和小麦产量的重要性。
不同疾病严重程度下根际微生物组的群落变化
Community shifts in the rhizosphere microbiome under different disease severity
基于上述结果，作者后续的分析集中于比较不同发病程度小麦根际土壤细菌和真菌群落的变化。在位点1（山东莒南），与健康小麦相比，重度发病小麦根际细菌和真菌群落的香农指数显着下降（t 检验，p < 0.05，图S4a）。此外，不同发病程度之间根际细菌、真菌群落结构存在显着差异（细菌群落：R2 = 0.3467，p < 0.001，ANOSIM；真菌群落：R2 = 0.4773，p < 0.001，ANOSIM）（图S4b）。而在位点2（江苏扬州）和位点3（河南驻马店），不同发病程度之间根际微生物群落多样性和群落结构无显著差异（图S5、S6）。作者进一步使用LEfSe分析以识别不同发病程度小麦根际微生物标志物。作者分别在位点1、位点2和位点3鉴定了15、25和26个细菌和真菌类群作为生物标志物（图3a、图S7a-S8a）。健康根际生物标志物包括Sphingomonas, Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium, Umbelopsis, Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia, Rokubacteriales, Pseudoxanthomonas, Filobasidium, and Tetracladium，而患病根际生物标志物包括Pseudomonas, Tausonia, Fusicolla, Bipolaris, Stagonospora, and Thanatephorus。为了检验这些根际关键生物标志物之间的相关性以及潜在的竞争和合作关系，作者在分别在健康、中度和重度发病的小麦根际中构建了这些生物标志物的共生网络。有趣的是，我们发现，健康小麦根际生物标志物（如Sphingomonas和Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium）在健康小麦根际中呈显著负相关，而在患病小麦根际中呈负相关（图3b），这意味着Sphingomonas和Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium在健康小麦根际中存在潜在竞争，而在发病小麦根际中转变为相互协作关系。
图3 山东莒南地区（位点1）健康、中度发病和重度发病根际细菌和真菌生物标志物及其互作网络。
(a) LEfSe分析识别在不同发病程度之间存在显着差异的细菌和真菌类群（生物标志物）（LDA > 4 且 p < 0.05）。从外到内，分支图的五个环分别表示门、纲、目、科和属水平。
(b) 健康、中度患病和重度患病根际生物标志物的互作网络（|r|> 0.6，p < 0.05）。每个节点的颜色代表健康（绿色）、中度患病（黄色）和严重患病（红色）根际的生物标志物（属水平）。红线代表正相关，蓝线代表负相关。
预测小麦健康状况的生物标志物
The top biomarkers to predict the health status of wheat
微生物生物标志物对于早期疾病检测、产量预测、质量评估、环境胁迫监测、育种、优化资源利用和加强精准农业实践至关重要。作者使用随机森林方法筛选出可区分不同发病程度的前10生物标志物，并解析了它们与土壤化学性质、P. graminis丰度、WYMV载量以及小麦产量的相关性（图4a）。作者发现，健康根际的前10位生物标志物普遍与土壤有机碳、土壤有效磷、有效钾和pH呈负相关，而患病根际的生物标志物普遍与土壤有效磷、溶解态磷、有机氮、铵态氮和硝态氮呈正相关（图4b）。作者进一步使用结构方程模型进行深入分析表明，前10的微生物生物标志物不仅与小麦产量呈直接正相关，而且还通过影响微生物群落和禾谷多黏菌丰度来间接影响小麦产量（图5）。有趣的是，健康根际的大多数生物标志物，如Sphingomonas, Allorhizobium-Neorhizobium-Parararhizobium-Rhizobium, Mucilaginibacter, Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia, Pseudoxanthomonas, Rokubacteriales, and Pedosphaeraceae以及真菌属Umbelopsis和Nigrospora与小麦产量呈正相关；相反，患病小麦根际土壤中的细菌属Pseudomonas、Terrabacter和Blastococcus以及真菌属Tausonia、Naganishia、Fusicolla等生物标志物均与产量呈显着负相关（图4b）。此外，我们发现健康根际的关键生物标志物Sphingomonas和 Allorhizobium-Neorhizobium-Parararhizobium-Rhizobium不仅在健康小麦植株的根际中表现出大量富集，与WYMV载量呈显著负相关，而且与小麦产量呈正相关。因此，这两种微生物可能在抵御病毒侵染，维持小麦健康方面发挥着至关重要的作用，为进一步阐明小麦植物微生物组介导的抗病性的潜在机制提供了思路。
图4 健康、中度发病和重度发病小麦根际土壤前10微生物标志物及其与土壤化学性质、P. graminis丰度、WYMV载量和小麦产量的相关性。
(a) 每个采样点健康、中度发病和重度发病小麦根际前10微生物标志物；
(b) 前10微生物标志物的相对丰度与土壤化学性质、禾谷多黏菌丰度、WYMV载量和小麦产量之间的相关性。
图5 小麦根际微生物标志物、土壤微生物群落、土壤化学性质和P. gramins丰度对小麦产量的影响。
(a) 微生物标志物、土壤微生物群落、土壤化学性质和小麦根际禾谷多黏菌丰度对小麦产量的标准化总效应。
(b) 结构方程模型显示生物标志物（以前10微生物标志物的归一化表示）、土壤微生物群落（以丰富度、PCoA1以及相对丰度前10的门归一化表示）、土壤化学性质、小麦根际中禾谷多黏菌的丰度和小麦产量之间的关系。实线箭头表示影响显著，虚线箭头表示影响不显著。绿色线条表示正向影响，红色线条表示负向影响。箭头的宽度表示标准化的路径系数的强度。
鞘氨醇单胞菌和根瘤菌对小麦生长和抵御WYMV侵染的影响
Effects of S. azotifigens and R. deserti inoculations on wheat growth and defense against WYMV
上述研究表明，健康根际的关键生物标志物，如Sphingomonas和Allorhizobium-Neorhizobium-Parararhizobium-Rhizobium，其相对丰度不仅与WYMV载量呈显著负相关，而且与小麦产量呈显著正相关。因此推测这两种微生物可能在抵御病毒侵染，维持小麦健康方面发挥着至关重要的作用。为了验证上述潜在有益微生物对小麦的促生抑病效果，作者成功从位点1（山东莒南）的健康小麦植株（cv.“LM 4”）的根际中分离出了两株细菌属Sphingomonas和Allorhizobium-Neorhizobium-Parararhizobium-Rhizobium属的菌株，经鉴定后，分别为S. azotifigens和R. Deserti。通过序列匹配和系统发育树构建（图S9），作者发现S. azotifigens和R. Deserti的序列分别与ASV195（属于Sphingomonas属）和ASV48（属于Allorhizobium-Neorhizobium-Parararhizobium-Rhizobium属）的序列匹配，准确度为100%。同时，与患病小麦根际相比，健康小麦根际中ASV195和ASV48的丰度显着更高，表明这两个分离株对应于ASV195和ASV48，并且确实在健康根际中富集。
因此，作者通过水培实验研究S. azotifigens和R. Deserti对小麦植株生长和WYMV载量的影响。试验分为两组，一组为未受WYMV侵染组，另一组为受到WYMV侵染组。结果表明，无论WYMV侵染与否，与对照（不接种微生物）相比，接种S. azotifigens和R. Deserti后，小麦株高提高约12%、地上部生物量提高约11%)、根直径提高约15%、根体积提高约35%（p < 0.05，图6a，图S10）。同时，在受到WYMV侵染组，与对照（不接种微生物）相比，单独接种S. azotifigens或联合接种S. azotifigens和R. Deserti后，WYMV的丰度降低了约83%（p < 0.01）（图6b）。
图6 潜在有益菌株（R. Deserti 和S. azotifigens）对小麦生长和WYMV抗性的影响。
(a)在WYMV未侵染/侵染条件下，仅接种S. azotifigens (S)、仅接种R. Deserti (R) 、同时接种S. azotifigens和R. Deserti (S + R) 后小麦的株高和地上部生物量；
(b) WYMV侵染14天后，在S、R和S+R处理下，WYMV在小麦叶片中的载量；
(c) WYMV未侵染/侵染条件下各处理小麦植株照片（WYMV感染后14天拍摄）。
进一步利用转录组测序研究S. azotifigens和R. Deserti的促生抗病机制（图S11-S12）。作者发现，在未受到WYMV侵染组中，当接种S. azotifigens和R. Deserti时，与对照相比，生长素和细胞分裂素途径中的基因，包括生长素（AUX）、吲哚-3-乙酸（IAA）、生长素反应因子（ARF）、细胞分裂素受体（CRE1），反应调节因子（ARR）蛋白编码基因显著上调（log2 fold change at least > 2，p < 0.05）。在受到WYMV侵染组中，接种S. azotifigens和R. Deserti与对照相比，参与JA和SA途径的基因，包括转录激活因子（MYC2）和发病相关蛋白（PR-1）相关基因显著上调（log2 fold change at least > 2，p < 0.05）（图7a）。
图7 在WYMV未侵染/侵染条件下，接种潜在有益菌株后（R. Deserti和S. azotifigens）小麦激素途径变化。
植物激素信号转导通路（I.生长素信号通路；II.细胞分裂素信号通路；III.茉莉酸信号通路；IV.水杨酸信号通路）。热图显示所有处理相对于对照差异表达基因（DEG）的对数倍数变化。NR、NS和NSR分别表示WYMV未侵染组中仅接种R. Deserti、仅接种S. azotifigens和同时接种S. azotifigens和R. Deserti；R、S和SR分别表示在WYMV侵染组中仅接种R. Deserti、仅接种S. azotifigens和同时接种S. azotifigens和R. Deserti。
- 结论 -
本研究通过采集小麦黄花叶病高发区，不同发病程度的小麦及其根际土壤样本，综合利用差异分析、机器学习和相关性分析的手段，识别了保障小麦健康的潜在有益根际微生物类群，分离培养获得相应菌株后，将其回接至染毒小麦根际，发现根际有益微生物可通过激活小麦茉莉酸和水杨酸途径，显著降低WYMV载量。以上研究结果揭示了根际微生物在抵御土传病毒侵染中的重要作用，并强调了利用根际有益微生物激活植物抗性在土传病害绿色防控和维持植物健康中的潜力。
图8 示意图
健康的根际土壤以存在假定有益微生物为标志，而患病的根际土壤则与以更高比例存在假定病原体的病原生物群相关。在健康的根际土壤中，有益微生物种群之间相互竞争，而在患病的根际土壤中，它们则相互合作。这些有益微生物可以通过激活植物激素信号传导途径（包括细胞分裂素信号、茉莉酸信号和水杨酸信号）来促进植物生长并增强小麦的抗病性。
参考文献
Wang, F., Zhang, H., Liu, H. et al. Combating wheat yellow mosaic virus through microbial interactions and hormone pathway modulations. Microbiome 12, 200 (2024). https://doi.org/10.1186/s40168-024-01911-z
- 作者简介 -
第一作者
宁波大学
汪方燕
23级生物学博士在读
汪方燕，宁波大学23级生物学博士在读，主要研究方向为土传病害微生物机制及其绿色防控措施。在Microbiome、Plant and soil等期刊发表第一作者论文2篇。
团队及通讯作者简介
宁波大学植物病毒研究所陈剑平院士团队微生物生态与土壤健康小组聚焦土传病害微生物生态防控，先后主持国家“优青”、面上项目、国家重点研发课题等科研任务20余项。
宁波大学
植物病毒学研究所
葛体达
研究员
葛体达，宁波大学植物病毒学研究所研究员，农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室PI，领衔微生物生态与土壤健康研究小组，主要从事土壤微生物生态研究。国家“优青”项目负责人，德国“洪堡学者”、英国"牛顿高级学者”；国家现代农业产业技术体系（食用豆体系土壤与生态管理）岗位科学家；主持了国家“优青”、面上项目、国家重点研发课题等科研任务20余项。以第一或通讯作者在Global Change Biology、Environmental Science & Technology、Soil Biology and Biochemistry等期刊发表论文60余篇，论文总引8000余次，H指数54（截止2023年10月），连续三年入选全球前2%顶尖科学家榜单。担任Plant and Soil、Ecosystem Health and Sustainability的学科编辑；相关成果获省湖南省自然科学一等奖、上海市科技进步二等奖各1项，制定国家标准1项，授权国家发明专利6件，参与国家标准制定1件；荣获中科院卢嘉锡青年人才奖、中国土壤学会优秀青年学者奖、中国生态学会青年科技奖等荣誉。兼任中国土壤学会青年工作委员会副主任委员等。
宁波大学
张昊青
师资博士后
张昊青，2021年作为宁波大学师资博士后引进。以小麦/设施果蔬及其重要病原物为研究对象，利用土壤生态学、微生物组学、植物生理学交叉研究体系，揭示植物-微生物-病原的互作机制，研发土传病害、连作障碍防治新技术。以第一作者/通讯作者在Microbiome、Geoderma、Agriculture Ecosystems & Environment等期刊发表SCI论文10余篇。主持国家重点研发子课题2项、国家自然科学青年基金、面上基金和中国博士后基金各1项。
猜你喜欢
iMeta高引文章 fastp 复杂热图 ggtree 绘图imageGP 网络iNAP
iMeta网页工具 代谢组MetOrigin 美吉云乳酸化预测DeepKla
iMeta综述 肠菌菌群 植物菌群 口腔菌群 蛋白质结构预测
10000+：菌群分析 宝宝与猫狗 梅毒狂想曲 提DNA发Nature
一文读懂：宏基因组 寄生虫益处 进化树 必备技能：提问 搜索 Endnote
16S功能预测 PICRUSt FAPROTAX Bugbase Tax4Fun
生物科普: 肠道细菌 人体上的生命 生命大跃进 细胞暗战 人体奥秘
写在后面
为鼓励读者交流快速解决科研困难，我们建立了“宏基因组”讨论群，己有国内外6000+ 科研人员加入。请添加主编微信meta-genomics带你入群，务必备注“姓名-单位-研究方向-职称/年级”。高级职称请注明身份，另有海内外微生物PI群供大佬合作交流。技术问题寻求帮助，首先阅读《如何优雅的提问》学习解决问题思路，仍未解决群内讨论，问题不私聊，帮助同行。
点击阅读原文，跳转最新文章目录阅读
