摘 要
摘要：通过研究蜂王浆蛋白体外消化产物对胃癌细胞SGC-7901增殖、凋亡的影响，并探讨其可能的作用机制，为蜂王浆蛋白辅助治疗胃癌奠定实验基础。
采用碱提酸沉法提取蜂王浆蛋白，并通过体外模拟消化实验得到蜂王浆蛋白体外消化产物，然后用不同质量浓度的蜂王浆蛋白体外消化物诱导体外培养的胃癌细胞SGC-7901，通过倒置显微镜观察其对胃癌细胞形态的影响，并通过集落形成实验检测诱导后胃癌细胞的集落形成能力；采用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法检测其对胃癌细胞增殖的抑制作用，通过流式细胞术检测细胞周期及凋亡，并通过蛋白质印迹法检测其诱导后胃癌细胞中p53和PARP-1蛋白的表达情况。
结果表明：蜂王浆蛋白体外消化产物使胃癌细胞形态发生皱缩，细胞密度降低，集落形成能力降低（P＜0.05），对胃癌细胞SGC-7901的增殖具有抑制作用。0.2mg/mL体外消化产物经24h和48h培养后对胃癌细胞抑制率分别达到（57.58±3.48）%和（62.84±1.98）%（P＜0.05）。
与空白对照组相比，蜂王浆蛋白体外消化产物对SGC-7901细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖性，S期细胞减少，从而引起细胞凋亡；且经蜂王浆蛋白体外消化产物诱导后，胃癌细胞中p53蛋白表达量增加（P＜0.05），PARP-1蛋白表达量减少（P＜0.05）。
说明蜂王浆蛋白体外消化产物能抑制胃癌细胞SGC-7901的增殖并诱导其发生凋亡，其机制可能与p53表达上调和PARP-1表达下调有关。
胃癌是全球范围内常见的恶性肿瘤，是消化系统疾病中发病率最高的肿瘤之一。目前，临床治疗胃癌的主要手段包括手术切除、放疗、化疗等，其中化疗药物主要为小分子药物，具有较高的毒副作用。为降低化疗药物的毒副作用并延长患者生存期，临床上常采用具有抗肿瘤活性的食品进行辅助治疗。因此，开发出具有抑制肿瘤作用的食品，利用食品进行防癌和抗癌更具有实际意义。当今很多国家都投入巨款开发和使用抗肿瘤食品，我国也逐渐开始重视该方面的研究。
蜂王浆是由5～15日龄的成年工蜂上颚腺、咽下腺和脑后腺分泌的一种浆状黏稠物质，是蜂王幼虫整个发育期和雄蜂幼虫发育前期的唯一食物，营养非常丰富。蜂王浆主要作为保健食品、膳食补充剂及化妆品的原材料，并有潜力成为治疗药物的原材料。营养学家认为，蜂王浆具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗氧化、增强记忆力、调节免疫、抗菌、修复组织损伤等。蛋白质是生物生长发育所必需的营养物质，而蜂王浆的重要医疗保健作用和生物学功能如抗肿瘤、抗氧化、抗菌等，可能与其中的蜂王浆蛋白密切相关。JIANG等通过实验发现，蜂王浆蛋白对人胚肺成纤维细胞具有抗衰老作用；彭瑜等通过实验证实，蜂王浆冻干粉可以提高小鼠脾细胞的增殖能力。
蛋白质作为人体必需的营养物质，进入人体后会被胃蛋白酶、胰蛋白酶、肠肽酶水解，形成多肽、小肽、氨基酸等，其中小肽具有多种生理活性，如抑制细胞变性、激活细胞活性、修复人体变性细胞等，并且具有高活性、易吸收、易穿透肿瘤细胞等特点。
锦州医科大学食品科学与工程学院联合锦州医科大学生物化学与分子生物学教研室通过体外消化模拟实验，探究蜂王浆蛋白体外消化产物对胃癌细胞的影响作用，为其对抗肿瘤机制研究提供实验依据，为天然抑制肿瘤细胞物质的筛选提供方向。
2结果与分析
2.1提取的蜂王浆蛋白消化产物的消化率
体外消化模拟实验可以准确模拟体内消化生理过程，操作简单且重复性好。经检测，样品中蛋白质总量为2g，经过胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解作用后，水解液中可溶性蛋白质质量为0.57g，蜂王浆蛋白的体外消化率达到71.5%。从此结果可以得知，蜂王浆蛋白是一种易消化的物质，适用于人体的消化吸收。
2.2蜂王浆蛋白体外消化产物对细胞形态学的影响
与DMSO对照组相比，蜂王浆蛋白体外消化产物对肾上皮细胞293T形态、密度均无可见影响；DMSO对照组胃癌细胞SGC-7901形态饱满，排列紧密，而经过蜂王浆蛋白体外消化产物干预48h后的胃癌细胞发生明显皱缩，密度降低，数目减少。且在蜂王浆蛋白体外消化产物质量浓度为0.2mg/mL时，胃癌细胞数目最少，皱缩最为明显，0.1mg/mL质量浓度的影响次之。由此得出，在诱导时间相同情况下，蜂王浆蛋白体外消化产物对胃癌细胞形态的影响具有浓度依赖趋势，对正常细胞可能未产生影响，而对胃癌细胞具有抑制作用，且抑制效果与蜂王浆蛋白浓度呈正相关。
2.3蜂王浆蛋白体外消化产物对细胞集落形成能力的影响
在诱导时间相同条件下，与DMSO对照组相比，蜂王浆蛋白体外消化产物对肾上皮细胞293T的集落形成能力没有抑制效果，反而有促进作用，而对胃癌细胞SGC-7901的集落形成能力具有明显抑制效果，其中在蜂王浆蛋白体外消化产物质量浓度为0.2mg/mL时，抑制效果最为明显，质量浓度为0.1mg/mL时效果次之。由此得知，蜂王浆蛋白体外消化产物对胃癌细胞的集落形成能力具有抑制作用，且具有浓度依赖趋势。
2.4蜂王浆蛋白体外消化产物对胃癌细胞增殖的影响
与DMSO对照组相比，蜂王浆蛋白体外消化产物对胃癌细胞的增殖具有显著抑制作用，抑制率随浓度的增加和时间的延长逐渐增加，其中，在质量浓度为0.2mg/mL时，经24h和48h培养后蜂王浆蛋白体外消化产物对胃癌细胞抑制率最高，分别达到（57.58±3.48）%和（62.84±1.98）%。由此表明，蜂王浆蛋白体外消化产物对胃癌细胞的增殖抑制能力具有时间和浓度依赖性。
2.5蜂王浆蛋白体外消化产物对胃癌细胞周期的影响
实验采用流式细胞术对经蜂王浆蛋白体外消化产物干预后的细胞周期分布进行了检测。与DMSO空白对照组相比，随着蜂王浆蛋白质量浓度的升高，胃癌细胞SGC-7901中G1期细胞占比升高，S期细胞占比降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。这表明蜂王浆蛋白作用于SGC-7901细胞48h后，DNA合成受阻，细胞减少，细胞增殖受到抑制。
2.6蜂王浆蛋白体外消化产物对胃癌细胞凋亡的影响
实验采用7-AAD和PE双染法检测细胞凋亡率，添加蜂王浆蛋白体外消化产物进行诱导后，与空白对照组相比，各组早期凋亡率和晚期凋亡率均有增加；当蜂王浆蛋白体外消化产物质量浓度为0.2mg/mL时，凋亡率最高。SGC-7901细胞凋亡率随蛋白体外消化产物质量浓度升高而逐渐增加，表明蜂王浆蛋白体外消化产物可以促进胃癌细胞SGC-7901的凋亡，且具有剂量-效应关系。
2.7蜂王浆蛋白体外消化产物对胃癌细胞SGC-7901信号通路蛋白p53和PARP-1的影响
0.1mg/mL的蜂王浆蛋白体外消化产物能显著激活p53蛋白的表达（P＜0.05），且随着蛋白消化产物质量浓度的升高，p53蛋白表达量增加。0.05mg/mL的蜂王浆蛋白体外消化产物能显著下调PARP-1蛋白的表达（P＜0.05），且随着蛋白体外消化产物质量浓度的增加，PARP-1蛋白表达量减少。此结果从蜂王浆蛋白对胃癌细胞SGC-7901的作用方面进行了进一步验证，表明蜂王浆蛋白体外消化产物对胃癌细胞的增殖确实具有抑制作用，说明蜂王浆蛋白具有成为一种新型抗胃癌食品添加剂的潜力。
3讨论
胃癌是临床上威胁人类健康最常见的消化系统恶性肿瘤之一，其发病率和病死率位于所有肿瘤的第6位，严重威胁着人类健康。在食品领域，已有采用黑茶藨子（黑加仑）、绿豆、猕猴桃等多种天然产物来探究对胃癌细胞影响的研究。
实验中，以蜂王浆蛋白为原料，采用体外消化模拟实验制备蜂王浆蛋白体外消化产物，通过细胞学形态观察和集落形成实验发现，蜂王浆蛋白体外消化产物对肾上皮细胞293T的形态没有造成影响，而对胃癌细胞SGC-7901的形态和集落形成能力具有明显抑制效果。
通过MTT实验发现，蜂王浆蛋白体外消化物对SGC-7901的生长增殖具有明显的抑制作用，且具有时间、剂量依赖性，与王勇姿等通过实验得出蜂王浆蛋白对肝癌细胞增殖的影响效果一致。采用流式细胞术检测细胞周期及凋亡过程发现，经蜂王浆蛋白体外消化产物诱导后，胃癌细胞SGC-7901中G1期细胞占比升高，S期细胞占比降低，DNA合成受阻，引发细胞凋亡增多。这与陈立军等通过实验得出蜂王浆在体内抑制肿瘤的机制与其促进肿瘤组织坏死和细胞凋亡有关的结论一致。
p53蛋白被称为基因组的守护者，当DNA发生损伤时，p53在DNA的损伤修复中起着重要作用，是肿瘤的抑制基因。PARP-1是聚腺苷二磷酸核糖聚合酶家族中的一员，其催化活性约占家族酶活性的90%以上，在多种癌细胞及组织中呈现高表达。实验中，蜂王浆蛋白显著上调了SGC-7901细胞中p53蛋白的表达，同时，下调了PARP-1蛋白的表达，且蛋白表达水平与蜂王浆浓度相关。
4结论
实验表明蜂王浆蛋白体外消化产物可以抑制胃癌细胞的增殖并引起凋亡，其机制可能与p53蛋白表达上调、PARP-1蛋白表达下调密切相关，为胃癌的药物治疗提供了实验依据。因此，蜂王浆蛋白体外消化产物作为新一代抗肿瘤天然食品具有广阔的开发应用前景。
（来源：《浙江大学学报(农业与生命科学版)》 2019年05期；蜂王浆蛋白体外消化产物对胃癌细胞SGC-7901增殖和凋亡的影响及其可能机制；王天石 王馨梦 付莉 ）
