来源：高分子科学前沿
脊椎动物展示了多样的皮肤附属器官，包括羽毛、毛发和鳞片。这些微小器官促进了各种功能，从机械保护和温度调节到性展示。先前的研究已经表明，不同皮肤附属器官的早期胚胎发育在广泛上是保守的。通常，这些单元从解剖学上的原基板发育而来，原基板在表皮和其下方的真皮中具有保守的分子信号。毛发、羽毛和鳞片的模式形成关键需要图灵反应-扩散型动态，这是一种由激活剂和抑制剂形态发生素之间的化学相互作用产生的“图灵斑图”。然而，体外研究表明，皮肤附属器官的自组织周期性模式也可能涉及力学行为——例如，间质细胞的局部聚集和收缩通过β-连环蛋白的机械感应信号激活羽毛原基的发展。在鸡中，真皮中形态发生素表达的嵌套空间斑块也可能赋予相应组织域不同的材料属性，从而通过弹性不稳定性产生羽毛原基的萌芽。
对发育中的鳄鱼胚胎的分析表明，它们的头部鳞片（即覆盖面部和颚部的鳞片），而不是身体鳞片，构成了不规则的、不重叠的、高度角化的皮肤的多边形凸起（图1a）。这些头部鳞片并非从原基板发育而来，通过典型的化学反应-扩散模式和假设的机械反馈在空间上组织，而是似乎源于一种纯粹的机械过程，产生了类似材料裂纹的模式。对于这种表面相似性的一个推测性解释是，皮肤细胞的增殖可能与鳄鱼胚胎颚骨架快速生长产生的机械张力紧密相关。更具体地说，由张力驱动的增殖引发的任何局部皱褶都会导致张力在其尖端重新分布和积累，从而导致局部张力应力、局部增殖最大值和皱褶尖端的连续裂纹样传播。鉴于鳄鱼胚胎实验的难度很大，这种力学过程尚未经过测试。
近期，日内瓦大学Grigorii Timin和Michel C. Milinkovitch团队通过体内实验和数值模拟，否定了张力驱动的局部生长假设，并揭示出鳄鱼头部鳞片的边缘是由平面内压缩应力产生的内向皮肤皱褶，这种应力源自皮肤的快速近均匀生长。首先，作者对发育中的尼罗鳄胚胎进行卵内静脉注射表皮生长因子蛋白（EGF）处理，以促进表皮分化和生长，从而干扰头部鳞片形成的基础力学。在利用光片荧光显微镜（LSFM）量化这些结果时，作者发现这种处理导致鳄鱼胚胎的头部皮肤图案发生明显皱褶。通过在适当的胚胎阶段停止这种处理，这种“智慧”的皮肤皱褶网络在孵化后的鳄鱼中部分舒展，形成更小的多边形头部鳞片模式，即与凯门鳄的头部鳞片模式高度相似。接下来，作者利用大量的数值模拟验证了所有实验结果，模拟结果表明，正常的尼罗鳄头部鳞片模式形成过程只需要真皮与表皮之间的刚度差异，而不需要这两个粘附皮肤层的生长差异。最后，作者制作了一个皮肤皱褶模式的理论形态空间，说明真皮与表皮之间的生长和材料属性的变化能够轻易解释鳄类物种之间头部鳞片模式的多样性。该工作以题为“Self-organized patterning of crocodile head scales by compressive folding”的论文发表在最新一期《Nature》上。
1、头部鳞片的机械图案化
首先，作者研究了尼罗鳄从胚胎第48天（E48）到E63天头部鳞片的正常图案形成（图1b）。在E48天，伸长的颌部大部分看起来是光滑的（图1b左），除了上颌存在的鼻盘（白箭头）和散布在两个颌上的板状衍生的多感官器官（ISOs）。然而，到了E51天，第一批皮肤褶皱在上颌的侧背表面传播（图1b）。随着胚胎的继续发育，新的边缘出现、传播并相互连接形成多边形区域，直到E63天时，面部和颌部被不规则的、不重叠的鳞片覆盖（图1b右）。新的褶皱的成核和传播在E63天后迅速减少，并在E75天完成。
在上颌的背侧表面可以看到垂直于颌部长轴的大型、伸长的头鳞区域，而更小、更规则的多边形区域则出现在两个颌的侧面（图1b）。头鳞的出现伴随着骨骼的骨化和牙齿的发育。对上颌侧面的纳米压痕测试表明，鳄鱼头鳞的出现与从E48到E63天表皮表面逐渐增加的刚度相关（图1c），这表明组织密度和角化的增加。传播的鳞片边缘避开了ISOs。
胶原蛋白是细胞外基质中丰富的结构蛋白，是决定组织特定材料性质的关键因素。作者对E48天鳄鱼上颌的高分辨率共聚焦成像显示，上颌背侧的真皮表现出高度有序的胶原纤维，这些纤维垂直于颌部长轴排列（图1d），即与随后在同一区域出现的伸长鳞片的方向相同（图1a,b）。相比之下，上颌侧面的纤维更加无序，缺乏单一的主导方向。作者假设胶原纤维的三维组织结构的这种变化，以及由此产生的真皮材料性质的不一致，有助于解释上颌背侧和侧面鳞片几何形状的差异。
图1. 鳄鱼头部鳞片发育动力学
2、EGF激动作用改变鳞片图案
作者猜想，鳄鱼面部和颌部鳞片的分级发育可能是由一种替代的、纯粹机械的、自我组织过程引起的：由真皮与表皮之间或皮肤与下层坚硬组织之间的差异均匀生长导致的压缩弹性不稳定性，最终以褶皱的形式出现。为了验证这一假设，作者在鳄鱼胚胎发育过程中，通过精确且重复的静脉注射EGF（图2a），在头鳞出现期间实验性地提高表皮生长和分化。
作者测试了多种EGF剂量和实验时间组合。在每次实验中，单个胚胎在实验第0天、第3天和第6天各注射一次，然后在第9天进行固定（或纳米压痕）处理（图2a）。处理并固定后，样品被处理用于激光扫描共聚焦显微镜（LSFM）以精确量化EGF处理导致的组织折叠几何形态的改变（方法）。从E55到E64用PBS对照注射处理的鳄鱼胚胎表现出正常的头部鳞片多边形区域图案（图2b）。相反，当用2微克EGF注射处理时，胚胎在上颌和下颌都发展出广泛的额外皮肤折叠（图2c），从而否定了张力场假设并验证了压缩场假设。更具体地说，EGF处理的胚胎在上颌背侧表面表现出更薄且数量更多的伸长鳞片区域，以及在颌侧表面出现迷宫般的折叠图案。
接下来，作者使用基于曲率的分割方法来检测褶皱（图2d），并量化了相应网络的几何和拓扑特征（方法）（图2e）：这些特征强烈地区分了对照组和EGF处理组。处理的效果是剂量依赖的，较高的EGF剂量对应于表皮生长和角化的增加以及皮肤折叠的增加。此外，EGF处理后的纳米压痕测量跨越两个独立的时间段，证实了由于过度角化导致的表皮表面硬度的剂量依赖性增加（图2f）。作者还检查了不同发育时间点EGF处理的效果（图2a）。从E51或E48开始的EGF注射也会导致组织折叠的显著增加和表皮表面硬度的增加（图2f）。
研究结果表明，实验性地增加表皮生长和分化广泛地改变了鳄鱼头部鳞片的折叠图案。这些结果验证了这些鳞片是由机械过程产生的猜想，但否定了更具体的假设，即折叠是由异质张力应力场导致的局部表皮增殖引起的张力驱动。相反，鳄鱼头部鳞片的自然图案是由于真皮与表皮之间的生长差异和/或材料性质的不同导致的全局压缩应力场造成的。
图2. 表皮生长的激动作用显著改变了鳄鱼头鳞片的图案
3、生物力学生长模型
接下来，作者使用激光扫描共聚焦显微镜（LSFM）来量化主导鳄鱼皮肤折叠的动力学过程。作者使用核染色来捕捉表皮和真皮的精确几何形态，以及使用红色素来捕捉下层骨骼的几何形态（图3a）。其次，使用Fast Green染色，作者确定了颌部真皮胶原蛋白纤维的主导取向（图3b）。作者检测了EdU标记的细胞，以确定表皮和真皮生长的空间变化，发现上颌背侧区域的皮肤生长率显著较低（图3c）。对以更高分辨率成像的皮肤样本中EdU+和EdU−细胞核的分割表明，真皮和表皮的生长率相似，前者甚至比后者高出20%。
图3. 利用LSFM估计鳄鱼头鳞片图案的力学参数
4、皮肤折叠的力学形态空间
胚胎生长的变异和皮肤层的材料性质提供了一个简单的进化机制，产生了鳄鱼类物种间头部鳞片图案的多样性。为了进一步研究这个猜想，作者通过改变相对的表皮与真皮生长率和弹性模量，产生了一个皮肤折叠图案的理论形态空间（图4a）。这种分析表明，这样的变异能够产生观察到的鳄鱼类头部鳞片图案的全部多样性，包括尼罗鳄、沼泽鳄、眼镜凯门鳄和美国短吻鳄的图案（图54–e）。
图4. 鳄鱼头部鳞片图案的形态空间
该工作揭示了鳄鱼头部的鳞片图案实际上是由力学层面的压缩不稳定性产生的。与之前报道中的结论不同，这些特定的弹性不稳定性并非由真皮与表皮的生长差异引起，而是由于它们不同的材料特性（主要是硬度）以及相对于下层组织的较大生长量。该工作证明了进化产生了两种生成鳄鱼类鳞片的方式：化学图灵不稳定性（身体鳞片）和机械不稳定性（头部鳞片）。
