导读：癌症疫苗驱动肿瘤反应性免疫细胞的激活和增殖，进而引发杀死肿瘤细胞的特异性免疫。鉴于LNP递送系统的成熟，体外转录（IVT）RNA在肿瘤免疫治疗方面具有显著的优势，包括线性、环状和自扩增mRNA疫苗。其中自扩增mRNA疫苗可在低剂量下高水平表达抗原且持续时间长，同时可刺激特定的细胞免疫。
2023年，中国食品药品检定研究院（简称中检院）研究团队在Frontiers in Immunology（IF:5.7）上发表综述《Amplifying mRNA vaccines: potential versatile magicians for oncotherapy》，总结了自扩增mRNA疫苗的研究进展及其在肿瘤治疗中的前景和未来方向。
01
背景介绍
肿瘤免疫疗法指通过激活免疫系统进行癌症治疗的一系列方法，如免疫检查点抑制剂、治疗性抗体和癌症疫苗等。癌症疫苗在肿瘤的主动免疫疗法中显示出积极作用，包括根除肿瘤细胞和预防肿瘤转移及复发，但癌症疫苗（如肽疫苗和细胞疫苗）抗原单一，抗肿瘤免疫激活效果差，生产成本高。
1995年，Conry等人首次提出使用mRNA进行肿瘤免疫治疗的概念。与传统疫苗相比，mRNA疫苗（线性、环状和自扩增mRNA疫苗）具有可快速编辑、生物安全风险低、激活T细胞及诱导更强免疫原性等优点。其中，自扩增mRNA疫苗具有以下优势：
（1）依赖于能利用RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）在宿主细胞内自扩增的RNA（saRNA），使载体携带的肿瘤抗原基因高水平、长时间表达；
（2）可在扩增过程中形成双链RNA（dsRNA），具刺激免疫反应的潜力，进一步增强疫苗效果；
（3）同时表达多种抗原，诱导针对不同抗原的体液和细胞免疫应答。目前43种COVID-19 mRNA疫苗中有14种为自扩增mRNA疫苗。因此，自扩增mRNA疫苗为传染病、癌症疫苗研究及应用提供广阔前景。
02
自扩增mRNA疫苗的研究历史
自扩增mRNA疫苗的研究可追溯至1957年将从感染Mengo脑炎病毒的腹水癌细胞中提取的RNA导入细胞，可合成完整的感染性病毒颗粒。1994年Zhou等人通过使用塞姆利基森林病毒（SFV）复制子表达流感病毒核蛋白在小鼠中产生具高抗体滴度的体液反应，并首次提出使用合成自扩增mRNA作为疫苗。1999年，Ying等人提出裸露、非感染性saRNA可用于癌症疫苗的开发。2003年，编码前列腺特异性抗原（PSA）mRNA疫苗的临床试验发现其在体内有效诱发T细胞介导的抗肿瘤免疫反应。第一个自扩增mRNA治疗性癌症疫苗AVX701于2007年进入I期临床试验。
自扩增mRNA疫苗技术平台已应用于流感、呼吸道合胞病毒（RSV）、狂犬病、埃博拉病毒和HIV-1等感染性病毒疫苗及黑色素瘤等癌症疫苗的临床研究。
图1 自扩增mRNA癌症疫苗发展里程碑
03
自扩增mRNA疫苗作用机制
除帽、5′-UTR、3′-UTR和poly（A）尾等常规结构元件外，自扩增mRNA在5′ORF内包含一个编码RdRp复合体（复制酶）和亚基因组启动子的序列，编码目标疫苗抗原的基因序列常位于亚基因组启动子下游。SINV、VEEV、SFV等甲病毒基因组常用于自扩增mRNA疫苗的设计。自扩增mRNA进入宿主细胞后，以宿主核糖体依赖性方式翻译，在宿主细胞内进行加工以形成复制酶，因自扩增mRNA序列为（+）链RNA，可被复制酶作为模板形成（–）链mRNA。（–）链mRNA的扩增导致两类（+）链RNA的合成：一是原始全长基因组RNA副本，二是编码目标基因的亚基因组RNA。鉴于自扩增mRNA序列中存在亚基因组启动子和目标基因（GOI），病毒复制酶可识别（–）链mRNA中的亚基因组启动子，合成大量含有目标基因序列的（+）链mRNA，低剂量下经翻译获得高水平目标产物。
图2 自扩增mRNA作用机制
RNA稳定性与序列长度呈负相关，自扩增mRNA相较于非扩增线性mRNA额外包含编码复制酶（7-8kb）的序列，稳定性较差。为解决上述问题，采用分裂载体反式扩增RNA系统（编码RdRp复合体的序列和编码目标基因的序列分成两个独立的转录本）进行递送，有助于控制mRNA大小，增强稳定性。
图3 反式扩增mRNA作用机制
04
自扩增mRNA癌症疫苗进展
自扩增mRNA癌症疫苗用于肿瘤抗原的高水平表达，在动物模型中引发强烈的细胞和体液免疫反应，有效抑制黑色素瘤、宫颈癌和前列腺癌等。该领域临床前研究主要集中在肿瘤相关抗原（TAA）、肿瘤特异性抗原（TSA）和免疫调节分子。
（1）TAA：对肿瘤细胞不具有特异性，但致癌过程中表达增加，临床前阶段自扩增mRNA癌症疫苗的设计主要靶向TAA，如酪氨酸酶、pMEL17/gp100、gp75/TRP 1、MART-1/melan-A和多巴色素互变异构酶/TRP-2。Avogadri等人研究发现基于表达TRP-2的VEEV载体自扩增mRNA癌症疫苗可诱导体液免疫对抗TRP-2，在黑色素瘤的免疫治疗中发挥作用，并配合肿瘤特异性CD8 T细胞反应。
（2）TSA：不存在于正常细胞，是癌症疫苗的理想靶标。超99%的宫颈癌表达E6、E7癌基因，Daemen等人使用SFV载体携带E6E7融合蛋白免疫的小鼠相较于单E6、E7蛋白，表现出更强的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应，导致肿瘤消退。
（3）免疫调节分子：Rodriguez Madoz等人使用表达IL-12的SFV载体治疗MC38细胞系结肠癌小鼠，显著增强小鼠的抗肿瘤免疫应答，导致肿瘤消退和完全根除。IL-18可促进NK和T细胞分泌IFN-γ和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），并增强与抗肿瘤CTL反应相关的Th1型细胞因子的产生。
表1 临床前研究进展
临床试验表明，自扩增mRNA癌症疫苗可增强T细胞免疫反应并改善患者预后和生存率。2022年11月9日，JCXH-211（编码人IL-12的新型samRNA治疗药物）被NMPA批准进入I期临床试验。Vvax001（治疗性疫苗）被评估在治疗HPV诱导的癌症中的免疫原性、安全性和耐受性。AVX701表达修饰的癌胚抗原基因（CEA（6D）），转移性结直肠癌患者I/II期临床试验结果表明，接种疫苗的患者表现出更强的T细胞免疫反应和更长的生存期。
表2 临床研究进展
05
自扩增mRNA癌症疫苗的优化策略
Blakney等人开发用于编码多种抗原的分裂复制子（splitzicon）系统，为多价RNA疫苗的设计提供思路。Li等人开发基于VEEV复制子系统的体外进化策略，筛选出的两种突变复制子相较于野生型复制子，荧光素酶表达的强度和持续时间显著增加。总之，优化自扩增mRNA载体序列以减少宿主先天免疫反应可显著提高稳定性和表达效率。
癌症疫苗应具备肿瘤特异性和诱导高水平且可控的抗肿瘤免疫反应的能力。TSA、TAA、免疫调节分子均用于癌症疫苗的抗原设计，现常采用联合疗法来增强癌症疫苗的效果，如多种抗原同时表达，与单抗原OVA1 mRNA相比，双抗原OVA1和OVA2 mRNA导致T细胞抗原特异性激活增加30%，增殖增加2倍。CD40L、CD70和组成型活性TLR4编码mRNA的共转染可增强人树突状细胞诱导的T细胞活化。
表3 临床和临床前研究中使用的癌症疫苗抗原
通过将质量源于设计（QbD）概念应用于IVT系统优化，可快速确定关键过程参数对关键质量属性（CQA）的影响。Samnuan等人采用实验设计方法研究影响IVT反应生产的自扩增mRNA产量的各种因素，确定最佳组分比，将其用于合成高产高质的自扩增mRNA。Moderna开发修饰的T7 RNA聚合酶，减少转录反应过程中的dsRNA杂质。新型嗜冷噬菌体VSW-3 RNA聚合酶能减少IVT过程中dsRNA副产物的产生。开发具高产率和低副产物形成的稳定IVT系统仍是未来研究的关键领域。
Miao等人使用含环状脂质成分的LNP刺激干扰素基因通路的刺激剂用于封装OVA mRNA疫苗，结果抗肿瘤作用显著增强。但开发用于癌症疫苗的新型递送系统仍存在如提高自扩增mRNA稳定性、靶向递送效率及免疫系统激活的可控性等挑战。
06
自扩增mRNA疫苗的质量控制
世界卫生组织、国家药品监督管理局药品审评中心等已发布相关指南和文件，为监管机构提供关于mRNA疫苗质量控制的考量和mRNA质量分析的方法。序列和完整性、含量和纯度、加帽和包封效率是mRNA疫苗特有的关键质量参数，决定其有效性和安全性。
QbD概念的应用能够准确测定mRNA疫苗的CQA、关键工艺参数和操作空间，有助于为生产过程建立合理的控制策略。为实现自扩增mRNA疫苗的质量控制，应进一步研究关键的CQA，如其稳定性和体内复制酶活性。监管机构和疫苗制造商还应考虑建立参考标准，用于测量自扩增mRNA的核酸含量、纯度和生物活性。关注疫苗序列完整性标志物的质量控制也至关重要。
07
总结
mRNA疫苗是癌症治疗领域有前途的技术平台。但其面临稳定性差、抗原选择和优化及靶向效率等障碍，在研发、生产、质量控制和安全性（自扩增mRNA疫苗可在体内不断产生新mRNA，应注意引起强烈全身或局部炎症反应的可能性）方面仍有诸多问题有待解决。
