纯干货！中医药大学：网络药理学+生物信息学+机器学习+实验+铁死亡，发11分+，真是王炸思路！

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发表时间：2024年9月29日

三阴性乳腺癌（TNBC）是女性乳腺癌导致死亡的主要原因。文献证实了红景天甙（Sal）治疗TNBC的益处。然而，关于Sal锚定TNBC的潜在治疗靶点和机制的研究仍然有限。 本研究旨在探讨Sal对抗TNBC的主要靶点和潜在机制。

整合了网络药理学、生物信息学和机器学习算法策略，以检查Sal行为在TNBC中的作用、潜在靶点和机制。选择MDA-MB-231细胞和荷瘤裸鼠进行体外和体内实验。使用CCK-8、LDH检测和钙黄绿素-AM/PI染色测定细胞活力和细胞毒性。使用谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛（MDA）、C11-BODIPY581/591探针和FerroOrange染料探索抗氧化防御、脂质过氧化和铁代谢。进行谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）或硬脂酰辅酶A去饱和酶1（SCD1）过表达或核受体共激活因子4（NCOA4）缺陷以证明Sal对TNBC的机制。

1）为了获得Sal的靶点，使用“Salidroside”作为关键字来搜索药物相关数据库。结果发现，Sal相关靶标在HERB中为37个，在ETCM中为30个，在CTD中为68个，在TargetNet中为55个（p >0）。排除重复项后，总共保留了178个靶标（图2A）。为了确定TNBC相关靶点，使用了OMIM、CTD和GeneCards数据库。TNBC靶标筛选条件的纳入标准在CTD数据库中设置为≥15分，在GeneCards数据库中将相关性分数设置为≥20。随后，通过条件筛选获得1374个靶点，包括OMIM（100）、CTD（473）和GeneCards（1021）（图2B）。为了提高结果的可靠性，从TCGA和GEO数据集下载了TNBC样本以进行DEG分析。结果发现，TCGA样本中识别出5252个DEGs，其中2666个DEGs下调，2586个DEGs上调（图2C-D）。同时，在GEO数据集中进行了DEG分析。然后为所有数据集生成主成分分析（PCA）图（图2E-F）。此外，共鉴定出2707个DEGs，其中包括1340个下调的DEGs和1367个上调的DEGs（图2G-H）。

2）此外，通过交叉疾病、TCGA和GEO数据库获得了3296个TNBC相关基因（图3A）。Sal基因和TNBC基因的这种交集获得了75个共享基因（图3B），这些基因代表了Sal抑制TNBC的治疗基因。为了探索Sal对TNBC的潜在机制，利用GeneMANIA工具对75个共享基因进行功能分析。结果显示，共享基因主要参与与氧化应激、对氧化应激的反应、响应氧化应激的细胞死亡、脂质生物合成过程的调节和脂质代谢过程的调节相关的过程（图3C）。铁死亡是一种铁依赖性程序性细胞死亡形式，由脂质过氧化和氧化还原失衡的氧化异常驱动。在导致细胞氧化应激的因素中，膜双层中脂质的氧化修饰，特别是脂质过氧化，已成为细胞命运的重要调节因子。广泛的脂质过氧化通过一种称为铁死亡的独特细胞死亡机制使细胞死亡 。因此，推测Sal对抗TNBC的潜在机制可能与铁死亡有关。此外，铁死亡诱导剂Erastin可以抑制与治疗剂量相关的细胞活性（图3D）。相反，Fer-1可以逆转这种效应（图3E），证明MDA-MB-231细胞中铁死亡的发生。进一步验证了Sal是否通过触发铁死亡来改善TNBC。将铁死亡抑制剂Fer-1、DFO和GSH添加到MDA-MB-231细胞中。结果显示，通过处理有关Fer-1、DFO和GSH的铁死亡抑制剂，Sal对细胞活性的抑制部分减轻（图3F-G）。在随后的实验中，选择了Fer-1进行进一步研究，主要通过调节细胞内抗氧化系统和铁代谢来抑制铁死亡。钙黄绿素-AM/PI染色显示，通过Fer-1给药处理部分减轻了细胞活性抑制（图3H）。随后，Fer-1添加显著提高了GSH水平。相比之下，Sal（图3I-J）和MDA降低GPX活性，Fe2+和Sal组的脂质ROS水平均显著升高（图3K-M）。然而，上述Sal组的结果被Sal+Fer-1部分逆转，表明Sal诱导MDA-MB-231细胞的铁死亡。

同时，对于Sal在体内的潜在抗癌活性，通过在雌性裸鼠中接种MDA-MB-231细胞获得了TNBC动物模型（图3N）。如图所示，与单独使用Fer-1和联合给药组相比，Sal组的肿瘤生长明显较慢（图3O-P）。此外，Sal组的肿瘤重量显著低于其他组（图3Q）。在治疗过程中，体重也表现出微小的变化，表明治疗没有明显的毒性并且耐受性良好（图3R）。此外，肿瘤组织的HE染色结果显示，Sal治疗组的坏死面积远高于其他组（图3S）。

此外，在Sal和Fer-1给药后，Ki67阳性区域比单独接受Sal的区域更明显地上调（图3S）。所有数据都表明，Sal可以对抗TNBC而不会产生明显的毒性作用。之后，GSH和GPX活性水平显著降低，但MDA和Fe2+与其他组相比，Sal组的水平升高（图3T-W）。然而，这一结果与联合组的结果相反。此外，IHC结果发现Sal组的4-HNE增强，表明Sal促进脂质过氧化物的积累（图3X）。同时，IHC分析中Sal组PTGS2阳性表达升高。这支持Sal通过诱导铁死亡在抑制TNBC肿瘤生长中至关重要的观点（图3X）。

3）在Sal和TNBC中鉴定了22个与铁死亡相关的基因，这些基因被定义为共享的FRG（图4A）。为了了解常见FRGs的生物学功能和信号通路，进行了GO、KEGG和GeneMANIA功能分析。最初，GO分析显著丰富。结果显示，主要生物过程（BP）涉及细胞对生物刺激、外部刺激和化学应激的反应。此外，细胞成分分析显示，这些基因主要与小窝、内质网腔和质膜筏相关。此外，关于MAP、蛋白丝氨酸和蛋白丝氨酸/苏氨酸的激酶活性是主要分子功能（图4B-C）。此外，Sal通过触发铁死亡治疗TNBC的疗效与KEGG富集途径密切相关，即脂质和动脉粥样硬化、mTOR信号通路、PI3K/AKT信号通路和自噬动物信号通路（图4D）。

之后，GeneMANIA工具进行了功能分析以揭示分子-功能关系。结果表明，这些基因与氧化应激、脂质和脂肪酸代谢过程、脂质生物合成过程以及自噬过程的调节密切相关（图4E）。

为了研究常见FRG的蛋白质相互作用，使用STRING在线工具构建了一个PPI网络（图4F）。随后，使用CytoNCA插件计算拓扑参数并提取核心PPI网络。靶标的程度由节点大小表示，从大到小（图4G）。同时，构建了一个药理学网络来表示Sal-FRGs-TNBC之间的关系，这为了解Sal、FRGs和TNBC之间的关联提供了一般理解（图4H）。随后，使用Cytohubba插件计算了前15个枢纽基因，其中包含HIF1A、IL6、mTOR、IL1B、PARP16、SIRT1、HMOX1、HSPA5、TGFB1、MAPK8、MAPK3、RELA、GSK3B、XBP1和MAPK1（图4I）。

本研究结合了三种机器学习算法，从PPI网络筛选的15个枢纽基因中识别共享的FRG（Sal和TNBC）相关的潜在诊断生物标志物。首先，从LASSO算法中获得11个生物标志物，包括HIF1A、IL6、mTOR、SIRT1、HMOX1、HSPA5、TGFB1、MAPK3、RELA、GSK3B和XBP1（图4JK ）。同时，RF算法根据它们的重要性确定了9个潜在的生物标志物（HSPA5、SIRT1、XBP1、MAPK3、HIF1A、HMOX1、GSK3B、IL6和mTOR;图4L-M）。此外，SVM-RFE分析显示，涉及10个基因（HSPA5、SIRT1、XBP1、MAPK3、GSK3B、HMOX1、HIF1A、IL6、MAPK1和mTOR）的模型建模达到了最高的准确性（图4N）。最后，将三种机器学习算法交叉，识别基因以获得候选生物标志物，即HIF1A、IL6、mTOR、SIRT1、HMOX1、HSPA5、MAPK3、GSK3B和XBP1（图4O）。

为了进一步检测HIF1A、IL6、mTOR、SIRT1、HMOX1、HSPA5、MAPK3、GSK3B和XBP1在TNBC患者中的重要性，分析了上述基因在TNBC患者和正常样本中的表达。在TCGA-TNBC测试集中，TNBC样本中HIF1A、mTOR、HMOX1、HSPA5和GSK3B的表达水平显著升高，而IL6、SIRT1、MAPK3和XBP1的表达降低。差异均具有统计学意义（图4P）。同时，验证数据集GSE61724与上述结果一致，除MAPK3外的所有基因均表现出一致的趋势（图4Q）。此外，验证数据集GSE21653的结果发现，除了SIRT1、MAPK3和XBP1的表达降低外，其余基因在TNBC患者中表达（图4R）。此外，使用人类蛋白质图谱（HPA）数据库中的IHC结果验证了上述基因的表达。IHC结果与上述结果一致。除XBP1外，HPA数据库中没有数据。HIF1A、IL6、mTOR、SIRT1、HMOX1、HSPA5、MAPK3和GSK3B在BC组织中表现出相同的增加趋势（图4S）。

在此之后，建立了ROC曲线并计算了AUC值，以评估上述基因的诊断价值。在TCGA-TNBC数据集中，所有基因的AUC均≥0.6，表明具有出色的诊断价值（图4T）。同时，在GSE61724和GSE21653验证集中获得的结果与上述结果几乎一致。在验证集中，除IL6和HSPA5外，所列基因的平均AUC值≥0.6（图4U-V）。这些结果为HIF1A、mTOR、SIRT1、HMOX1、GSK3B、MAPK3和XBP1作为TNBC的诊断生物标志物提供了强有力的证据。

4）上述生物信息学和网络药理学预测结果表明，Sal主要通过靶向PI3K/AKT和mTOR通路来改善TNBC的发病机制。此外，mTOR是Sal治疗TNBC的中心靶点。在这种情况下，选择mTOR作为检测PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白（PTEN、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR和mTOR）表达的关键靶点，以确认预测结果。

体外实验结果显示磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）的蛋白表达水平升高。然而，Sal组的p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT降低（图5A），表明Sal触发的铁死亡可能抑制PI3K/AKT通路。为了进一步否定Sal诱导的铁死亡机制，应用PTEN抑制剂VO-Ohpic三水合物和AKT激活剂SC79探讨PTEN和AKT在PI3K/AKT通路调节的铁死亡中的重要作用。结果表明，VO-Ohpic三水合物和SC79赋予MDA-MB-231细胞对Sal诱导的铁死亡的抵抗力（图5B-C）。除此之外，VO-Ohpic三水合物和SC79还显著降低了Sal诱导的MDA和亚铁水平升高（图5DE）。PI3K只是调节AKT激活的众多机制之一。因此，使用PTEN抑制剂来阐明PI3K/AKT通路在Sal介导的铁死亡中的作用。此外，VO-Ohpic三水合物可以改善Sal触发的p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT（图5F）。所有这些数据都探讨了，一方面，VO-Ohpic三水合物可以抑制Sal诱导的铁死亡。另一方面，Sal诱导的铁死亡机制主要是通过抑制的p-AKT/AKT通路。

为了进一步验证预测结果，通过WB检测了枢纽生物标志物mTOR的表达水平。Sal给药后p-mTOR/mTOR蛋白显著下调（图5G）。此外，作为mTORC1的底物，p-4EBP1/4EBP1在Sal给药后在蛋白质水平上下调（图5G）。之后，应用mTORC1激活剂MHY1485和抑制剂雷帕霉素进一步探索mTORC1在Sal调节的铁死亡中的作用。研究结果表明，用MHY1485预处理赋予细胞对Sal引起的铁死亡的抵抗力，而雷帕霉素增强了Sal诱导的铁死亡（图5H-I）。此外，MHY1485大大下调了Sal调节的MDA生成，而雷帕霉素反而增加（图5J）。Sal诱导的PTGS2蛋白水平升高被MHY1485显著抑制（图5K）。上述发现与预测结果一致。PI3K/AKT/mTOR的活性可能与MDA-MB-231细胞对Sal诱导的铁死亡的敏感性增加有关。

值得注意的是，铁死亡PI3K/AKT/mTOR信号通路在体内得到验证。PTEN蛋白水平上调，Sal给药后p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR下调（图5L）。

这进一步表明Sal主要通过靶向mTOR诱导铁死亡。综上所述，这些结果表明，Sal可能通过调节mTOR相关的PI3K/AKT/mTOR通路诱导铁死亡来改善TNBC。

5）测量GPX4和PTGS2以通过RT-PCR和WB方法检验预测结果。结果发现，Sal可以显着降低GPX4水平，而PTGS2的mRNA和蛋白质水平增加（图6A-B）。一致地，mTOR激活剂MHY1485显著改善了Sal诱导的GPX4表达抑制（图6C）。为了进一步研究GPX4是否与Sal调节的铁死亡有关，在MDA-MB-231细胞中获得了GPX4过表达（图6D）。与Fer-1给药一致，GPX4过表达的MDA-MB-231细胞活性抑制通过Sal处理部分缓解（图6E、H）。通常，MDA和PTGS2水平显著下调（图6G、I），而GPX活性由于GPX4过表达而增加（图6F）。因此，Sal诱导的铁死亡可能归因于GPX4降低。此外，数据证实了Sal处理的MDA-MB-231细胞中铁死亡的发生，Sal触发铁死亡的机制可能是通过GPX4信号通路调节mTOR介导的脂质过氧化。此外，在TNBC动物模型中测试了抗氧化防御过程中的GPX4信号通路。结果与体外实验一致。GPX4的mRNA和蛋白水平降低。相比之下，Sal治疗后PTGS2水平升高（图6JK），表明Sal可以治疗TNBC。其机制可能是通过抑制脂质过氧化中mTOR介导的GPX4信号通路来诱导铁死亡。

6）Sal处理后甾醇调节元件结合蛋白1（SREBP1）的mRNA和蛋白水平均显著降低（图7A-B）。此外，由于SREBP1影响与脂质合成相关的遗传转录，因此检测到下游相关基因的mRNA，包括乙酰辅酶A羧化酶（ACACA）、ATP柠檬酸裂解酶（ACLY）、脂肪酸合酶（FASN）和硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD）。相比之下，SCD显着下调（图7A）。同时，当用Sal处理时，SCD1的蛋白表达显著降低（图7B）。此外，mTOR激活剂MHY1485增加Sal诱导的SREBP1和SCD1蛋白表达（图7C）。SCD1可以调节单不饱和脂肪酸（MUFA）的生成，与饱和脂肪酸（SFA）的转化有关。因此，MDA-MB-231细胞用MUFAOA（18：1）和SFASA（18：0）预处理。最后，由于OA而不是SA，MDA-MB-231细胞似乎在更大程度上对Sal诱导的铁死亡具有耐药性（图7D）。Sal诱导的MDA水平降低也证实了抑制作用（图7E）。总体而言，研究结果显示Sal抑制了SCD1产生的MUFAOA的合成，这是SCD1诱导的铁死亡的主要原因。

为了证明Sal诱导的铁死亡归因于SCD1，在MDA-MB-231细胞中构建过表达质粒插入SCD1（图7F）。发现过表达的SCD1可以增加Sal诱导的细胞活力（图7GH）。同时，SCD1过表达后MDA和脂质ROS水平显着降低（图7IJ）。值得注意的是，Sal诱导的GPX4和PTGS2蛋白表达也被过表达的SCD1抑制（图7K）。这些发现相结合表明，Sal可能通过抑制脂肪酸合成中mTOR介导的SCD1信号通路来促进MDA-MB-231细胞的铁死亡。

此外，在TNBC动物模型中验证了脂肪酸合成中的SREBP1/SCD1信号通路。结果与体外实验一致。SREBP1和SCD1的mRNA和蛋白水平降低（图7L-M），表明Sal可以治疗TNBC。该机制可能通过抑制脂肪酸合成中mTOR介导的SCD1信号通路来诱导铁死亡。

7）为了进一步探讨TNBC自噬相关通路与铁死亡之间的关联，在Sal处理后检测到mRNA水平铁调节蛋白的改变，如转铁蛋白受体（TFRC）、铁反应元件结合蛋白2（IREB2）、铁蛋白重链（FTH）和NCOA4。观察到FTHmRNA下调，NCOA4mRNA显著上调，而其他mRNA没有变化（图8A），表明Sal诱导的铁死亡可能与铁蛋白自噬相关。随后，分析了Sal处理后铁蛋白自噬相关蛋白水平的变化，包括FTH、NCOA4、P62和LC3II/I。如图所示，在Sal处理的MDA-MB-231细胞中，NCOA4和LC3II/I水平上调，而FTH和P62水平显著下调（图8B）。令人惊讶的是，mTOR激活剂MHY1485显著抑制了Sal增加的LC3II/I水平，Sal提高了P62和FTH蛋白水平（图8C），表明Sal激活的铁蛋白自噬可能通过抑制mTOR途径。

为了研究铁蛋白自噬是否参与由Sal引起的铁死亡，用3-MA预处理细胞以抑制自噬体组装。结果显示，3-MA预处理显著提高了细胞活力并抑制了Sal诱导的MDA表达（图8D-F）。此外，Sal组FTH蛋白水平下调，而Sal+3-MA组FTH蛋白水平上调（图8G）。接下来，使用靶向NCOA4的siRNA研究NCOA4是否介导Sal触发的铁蛋白自噬，并通过WB证实转染功效（图8H）。根据这一点，选择siNCOA4#1进行进一步研究。敲低NCOA4使MDA-MB-231细胞抗铁死亡（图8I-J），MDA和Fe下调证明了这一点2+水平（图8K-L）。与此一致，NCOA4的敲低也抑制了PTGS2蛋白水平，同时提高了Sal诱导的FTH蛋白水平（图8M）。所有结果表明，铁死亡中自噬相关传代是NCOA4介导的铁蛋白自噬，Sal诱导的铁过载可能归因于mTOR通路调控的NCOA4介导的铁蛋白自噬。

随后，体内实验证实了NCOA4介导的铁自噬和铁死亡在Sal处理的TNBC中的作用。与对照组相比，Sal组LC3II/I和NCOA4水平升高，而P62和FTH显著降低（图8N-O）。这与体外结果一致，表明Sal可能通过mTOR介导的NCOA4调节的铁蛋白自噬促进铁死亡的发生。

预测结果证实，在Sal和TNBC中共鉴定出22个铁死亡相关基因，提示Sal作用于TNBC的潜在机制与铁死亡有关。此外，通过功能富集分析，这些基因主要参与mTOR、PI3K/AKT和自噬信号通路。体外验证结果证实，Sal通过提高细胞内Fe2+和脂质过氧化来调节铁凋亡，从而抑制TNBC细胞增殖。从机制上讲，Sal通过抑制PI3K/AKT/mTOR轴使TNBC细胞对铁凋亡敏感，从而抑制scd1介导的单不饱和脂肪酸的脂肪生成，诱导脂质过氧化，同时促进ncoa1介导的铁蛋白自噬，增加细胞内Fe2+含量。GPX4或SCD1过表达或NCOA4缺乏的结果进一步支持了机制研究。体内实验证实，Sal通过诱导铁下垂来减缓肿瘤生长。这些研究结果全面探讨了Sal抗TNBC的前瞻性治疗靶点及相关机制，为Sal在TNBC临床治疗中的应用提供了理论依据。本文整合了网络药理学、生物信息学和机器学习算法策略，同时还结合了铁死亡来研究Sal行为在TNBC中的作用、潜在靶点和机制，进行了大量的工作，是网络药理学发文中的一篇佳作！如果您也想通过更多的研究方法或结合当下的热点进行发文，现在就联系小编吧！

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