专家共识
近日，由中国医疗保健国际交流促进会临床微生物学分会专家联合制订的《靶向高通量测序在感染性疾病中应用与实践专家共识》（以下简称《共识》）发布。《共识》系统归纳了国内外tNGS在感染性疾病中的研究，提出符合我国临床实践的推荐意见，主要内容包括：共识制订过程、临床适应证、技术要点、湿实验与干实验、报告发放与解读和报告模板，以期规范tNGS在感染性疾病中的应用和实践。
tNGS应用于感染性疾病诊断的临床适应证
《共识》1：tNGS 的应用场景应与 mNGS 有所区别和侧重。对于非重症患者，传统微生物学检测阴性时，考虑送检 tNGS；病情危重或新发突发传染病时，考虑送检mNGS。
《共识》2：针对不同的感染部位，建议覆盖相应病原谱的 tNGS，比如肺部感染组套、中枢神经系统感染组套等。靶向病原谱应包括该症候群难培养、罕见的病原，不宜纳入该部位无临床意义的微生物。
《共识》3：tNGS结果阴性而临床仍高度怀疑感染时，考虑送检mNGS。
《共识》4：建议根据临床需求和医疗花费选择不同tNGS方法。多重PCR扩增tNGS方法靶标少，花费较低，而探针捕获tNGS方法覆盖病原谱广，花费较高。
《共识》5：临床高度怀疑结核分枝杆菌感染或抗酸染色阳性需鉴别非结核分枝杆菌（NTM）感染时，考虑选用包括结核分枝杆菌复合群及致病性 NTM的tNGS。
《共识》6：结核分枝杆菌培养和药敏试验时间长，建议 tNGS 用于呼吸道标本的结核分枝杆菌鉴定、耐药基因及其突变位点的检测。
《共识》7：临床怀疑特定耐药菌感染，并且耐药基因与耐药表型关联性强时，可考虑送检tNGS，作为常规方法的补充。重点关注碳青霉烯酶、超广谱β‑内酰胺酶（ESBLs）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、万古霉素耐药肠球菌（VRE）等耐药基因和病原体。
《共识》8：进行新型冠状病毒、流感病毒等病毒变异监测时，可考虑选择覆盖基因组全长的tNGS。
tNGS技术要点
《共识》9：建议 tNGS 引物或探针设计遵循特异、保守、碱基均匀的原则，引物/探针及目的片段大小应控制在适当的范围，如扩增子长度宜在 200 bp内，探针长度宜介于 80~120 bp。引物和探针需完成干实验和湿实验的性能评价。
《共识》10：tNGS实验过程中靶标被极大富集，核酸污染风险大，建议对实验室环境、试剂、实验操作、废弃物处理等制定严格的防污染制度和预案，并定期监测实验室核酸污染。
《共识》11：试剂工程菌、背景环境菌、环境中的气溶胶可能导致假阳性结果。建议通过生物信息分析建立试剂和环境的基线数据库，以提高检测准确性和可靠性。
《共识》12：tNGS检测中引物/探针、酶等关键原材料或检测流程中关键参数的调整可能影响检测性能。建议每次优化后的试剂和流程进行性能确认。
《共识》13：建议进行全流程质控，包含阴性对照、阳性对照、内参、数据量、数据质量等，且在临床报告中体现质控结果。
湿实验与干实验
《共识》14：核酸提取试剂盒应兼顾不同病原类型的提取效率，试剂工程菌不应涵盖在靶标范围内。
《共识》15：根据不同症候群、靶标范围、扩增富集效率等因素确定文库长度和最低测序数据量；测序平台的选择还应考虑测序准确性、稳定性、测序时间和成本等因素。
《共识》16：为确保数据质量可满足后续分析要求，建议实验室对原始测序数据进行质控和过滤，建立生物信息学数据库和分析流程，并针对此部分进行性能确认与验证。
《共识》 17：建议实验室在国际/国内公认的公共数据库的基础上筛选高质量序列，建立本地化比对参考数据库，可包括耐药基因和毒力基因。tNGS数据库还应关注引物扩增区域以及探针捕获区域的序列特征，用于病原分型及耐药基因突变位点检测。
《共识》18：实验室综合考虑标本类型、靶标类型、富集效率等因素，设立不同病原体的阳性判断值，并基于其他实验室检测结果、影像学和临床诊断等复合标准优化和确认该阳性判断值。
《共识》19：实验室应建立用于监测和管理生物信息学分析程序、流程及数据库的版本号，并记录版本日志，以保证报告的可复现性和可信度。
《共识》20：实验室应对生物信息分析的结果进行解释和验证，包括解释检出的微生物物种、基因以及突变位点的生物学和生物信息学的意义。
《共识》21：测序数据可考虑以 fastq 或 bam 格式双份存储于不同的储存介质，同时做好软件账户的访问权限控制。为保证数据安全，推荐部署本地服务器，并与外部网络物理隔离。
报告发放与解读
《共识》22：建议对报出的微生物致病性给出初步注解，分为致病性微生物、条件致病微生物或定植微生物。
《共识》23：建议结合标本类型、病原种类、均一化序列数等指标进行报告解读，在临床信息基础上判断该病原的致病等级。
《共识》24：阴性结果不建议单独作为排除依据，应结合 tNGS 的靶标覆盖范围、标本类型和其他临床辅助检查进行综合判断。
《共识》 25：建议结合相对应的病原微生物均一化序列数、耐药机制、tNGS的探针/引物设计靶标范围综合解读耐药基因检测结果。
报告模板
《共识》 26：tNGS报告单建议标注使用的 tNGS方法（探针捕获/多重 PCR 扩增），并可考虑分为以下主要部分：临床诊断、标本信息、病原微生物检测结果、耐药/毒力基因检测结果和病原致病性。
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供稿：感染事业部
