分子克隆实验概述
>分子克隆实验技术
根据以上表格内容，我们不难发现，针对入门克隆，只需要对序列进行测序或保存，TOPO克隆较TA克隆连接更加快速高效，且适用场景更广；而对于要进行下游定向的克隆实验，同源重组相比酶切连接具有不受酶切位点限制的显著优势。因此，达领生物为小伙伴们提供了基于TOPO克隆和同源重组克隆技术的分子克隆解决方案，供大家参考噢~
入门克隆——基于TOPO克隆技术的解决方案
TOPO克隆利用拓扑异构酶的催化作用，完成目的片段与线性载体连接（图2）。
拓扑异构酶同时具有限制性内切酶和连接酶的功能，首先，拓扑异构酶可以切割一条DNA链并与3'端T的磷酸基团形成共价键，使DNA解旋。随后，通过线性化DNA片段的5'端羟基进攻形成共价键，该酶从DNA上释放出来。最终载体与目的基因形成具有双切刻的环形重组分子。
>TOPO克隆实验方案
引物设计同普通PCR，注意引物5'端不可磷酸化修饰。
建议使用高保真酶进行目的片段的 PCR 扩增，并摸索退火温度，优化反应体系和程序。达达推荐大家选择“更高、更快、更强”的T8 Mix（货号：DLP201/TSE111）！
图3. 2×T8 High-Fidelity Master Mix产品特点
使用琼脂糖凝胶电泳鉴定，判断是否存在目的大小的条带。
推荐使用切胶回收的方式纯化，切胶时间最好控制在3 min内，避免紫外照射对DNA的损伤。推荐使用达领生物胶回收试剂盒（货号：DLN801），搭配配套切胶小工具（一按一推，2 s快速切胶），让你的实验更高效。
视频1. 切胶小工具演示视频
连接反应体系按照说明书要求投入，目的片段投入体积≥1 μL，若浓度过高可稀释后使用；
连接反应25°C反应5 min （若片段较大时，可加长连接时间至20 min以提高连接效率），反应完成后立即转化，请勿置于冰上或冰箱中，否则会降低连接效率。
图4. TOPO克隆实验操作步骤
连接反应建议在 PCR 仪中进行。 推荐使用达领生物TOPO克隆试剂盒，一步到位！
连接产物转化的感受态细胞选择使用DH5α等克隆用化学感受态细胞，如达领生物超级感受态（货号：DLC101/TSC-C01）。 感受态细胞不可反复冻融使用，从-80 ℃取出后建议一次用完。
重组产物体积与感受态细胞体积的比例为1:10，推荐10 μL重组产物加入至100 μL感受态细胞。
图5. 感受态转化涂板操作步骤
5.单克隆菌落PCR鉴定
挑取平板中体积大小适中的单克隆菌落，避免选择过大或过小的单克隆菌落；
挑取多个单克隆菌落进行鉴定分析；
推荐使用达领V5菌检试剂 (DLP601/
TSE0601) 进行PCR鉴定，只需3步，轻松搞定菌检PCR。
定向克隆——基于同源重组克隆技术的解决方案
1.引物设计与目的片段PCR扩增
引物同源臂设计要求：15~20 bp（不含酶切位点 )，GC含量40%~60%； 建议使用高保真酶进行目的片段的PCR扩增，并摸索退火温度，优化反应体系和程序。达达推荐大家选择“更高、更快、更强”的T8 Mix（货号：DLP201/TSE111）！
2.载体线性化
双酶切：同时选择两种限制性内切酶对载体质粒进行线性化处理。限制性内切酶的识别序列在载体中存在且唯一，在目的片段中不存在；不建议使用单酶切方式，载体易发生自身环化。 反向PCR扩增：以载体质粒为模板，以PCR扩增形式进行线性化。建议使用高保真酶扩增，降低突变引入，且模板质粒投入量不宜过多（50 μL投入1 ng），并使用DpnI对扩增产物消化。
3.目的片段/线性化载体纯化回收
同方案一：TOPO克隆——2. PCR产物鉴定及纯化回收
4.目的片段与载体的连接
连接反应体系按说明书要求投入，目的片段投入体积≥1 μL，若浓度过高可稀释后使用；
载体与插入片段的摩尔比为1:2~1:10；多片段连接时各片段之间摩尔比为1:1。
连接反应50 ℃反应15 min （若同源臂GC含量超过60%或连接片段数较多时，可加长连接时间提高连接效率，但最长不超过60 min）。
推荐使用达领生物同源重组克隆试剂盒，可有效克隆50 bp~20 kb的片段到线性化载体中，满足单片段、多片段、高通量等各种载体构建场景！
5.感受态转化涂板
连接产物转化的感受态细胞选择使用DH5α等克隆用化学感受态细胞，如达领生物超级感受态（货号：DLC101/TSC-C01）。
感受态细胞不可反复冻融使用，从-80 ℃取出后建议一次用完。
重组产物体积与感受态细胞体积的比例为1:10，推荐10 μL重组产物加入至100 μL感受态细胞。
挑取平板中体积大小适中的单克隆菌落，避免选择过大或过小的单克隆菌落。
挑取多个单克隆菌落进行鉴定分析。
推荐使用达领菌P专家 (名称：2×T5 Super PCR Mix (Colony) ；货号：DLP102/
TSE005) 进行PCR鉴定，这是一款专用于菌液/菌落PCR的扩增Mix，针对菌落、菌液PCR优化，适合于各种微生物来源的模板，是您PCR鉴定实验的理想选择!
7.质粒提取
质粒提取是克隆构建的最后一步，也是关键步骤。如果得到的质粒DNA质量越好，后续实验的成功率也会越高。
图9. 质粒提取实验操作步骤
推荐使用达领生物6 min质粒快提（名称：FlashPure快速质粒小提试剂盒；货号：DLN702/TSP0302）进行普通质粒提取，这是一款6 min可从1~5 mL的细菌培养物中提取多至35 μg的质粒DNA提取试剂盒，提取的质粒DNA可直接用于测序、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。
