β-羟基丁酸（BHB）是一种酮体，由肝脏产生。近年来，科学家们发现，当人体处在饥饿、间歇性禁食或生酮饮食期间，碳水化合物摄入低，BHB 含量会上升。这引起了人们对研究其在肥胖和糖尿病方面的兴趣。
近日，来自美国贝勒医学院、斯坦福大学的科学家在 Cell 期刊发表了一项研究发现，BHB 还参与了另一种代谢途径，一种名为 CNDP2 的酶将 BHB 与氨基酸结合在一起。此外，最丰富的 BHB- 氨基酸 BHB-Phe 可以影响动物模型的体重和新陈代谢。
介导肝脏 BHB 生成和肝外 BHB 氧化的经典主要代谢途径已得到证实。重要的是，所有已知的 BHB 代谢途径都涉及 BHB 与直接用于 ATP 生成的初级中间体的相同代谢相互转化。迄今为止，尚未见报道初级代谢之外的 BHB 代谢途径。
CNDP2（肌肽二肽酶 2）可在体外催化乳酸和氨基酸的缩合，从化学角度来看，BHB 和乳酸表现出高度的结构相似性：两者都是仅相差一个亚甲基的羟基脂肪酸。因此，BHB 可能像乳酸一样，也可以通过酶促方式与氨基酸结合。
首先，研究人员为了确定 CNDP2 是否能催化氨基酸 BHB 乙酰化，将 BHB 和苯丙氨酸（各 20mM）与 HEK293T 细胞的细胞裂解液孵育，通过蛋白印迹法证实了 CNDP2 蛋白的过表达。37℃ 孵育 1 小时后，使用液相色谱-质谱（LC-MS）来测定预期缩合产物 BHB-Phe 的量，结果显示转染 CNDP2 的细胞裂解液比转染 GFP 的细胞裂解液苯丙氨酸 BHB 乙酰化高 140 倍。进一步测量动力学数据后，发现动力学数据符合米凯利斯-门滕动力学，表明 BHB 实际上是一种对 CNDP2 活性位点更高亲和力的底物。
图 | CNDP2 在体外催化氨基酸 BHB 乙酰化
为了进一步确定内源性CNDP2 是否催化小鼠组织中的氨基酸 BHB 乙酰化，研究人员使用免疫印迹检测 CNDP2 的组织表达，并设计了 CNDP2-KO 小鼠验证其抗体特异性。结果显示 CNDP2 蛋白水平在肾脏和肠道中最高，而在许多其他组织中则较低，因此研究人员使用这些部位的组织细胞来确定 CNDP2 对组织 BHB-Phe 合成活性的作用。结果显示在 CNDP2-KO 小鼠的组织中，肾脏和肠道中 BHB-Phe 的合成活性降低了 95%，其他组织中较小的 BHB-Phe 合成活性也大大降低，证明了 CNDP2 是小鼠组织中负责 BHB- 氨基酸合成活性的主要酶。
图 | CNDP2 是小鼠组织中主要的 BHB- 氨基酸合成酶
CNDP2 催化的 BHB- 酰化反应的产物，BHB- 氨基酸，并未被证明是一种内源性代谢产物。因此，研究人员开发了一种靶向代谢组学方法来确定 BHB- 氨基酸是否可以在小鼠血浆中检测到。结果显示内源峰的信号占 99%，BHB-Phe 为内源性信号。随后研究人员在生酮饮食、24 小时禁食或口服酮酯饮料（3 克/公斤体重）1 周后，测量小鼠血浆中的 BHB- 氨基酸水平，发现其水平在这些条件下都是升高的，这再次证明 BHB- 氨基酸是内源性的，且是酮症诱导的小鼠代谢物。
图 | 小鼠血浆中 BHB- 氨基酸的检测及酮症诱导性
为了直接测试 CNDP2 对 BHB- 氨基酸生物合成的生理作用，研究人员测量了 CNDP2-KO 小鼠在酮酯饮料刺激后或1周生酮饮食后血浆中的 BHB- 氨基酸。急性给药酮酯饮料后，90% 的 CNDP2-KO 小鼠表现出血浆中多种 BHB- 氨基酸降低。生酮饮食的 CNDP2-KO 小鼠 1 周后也观察到多种 BHB- 氨基酸的减少。
接下来，研究者又探索了肝脏特异性缺失 HMGCL 的影响，HMGCL 是肝酮生成过程中一个关键的上游酶。HMGCL 肝脏特异性 KO 小鼠血浆中，一些 BHB 氨基酸降低。这些实验证明了 HMGCL 和 CNDP2，作为两种上游调节酶，在调节循环 BHB- 氨基酸水平的过程中起到一定的作用。
图 | CNDP2 和 HMGCL 对 BHB- 氨基酸的遗传调控
随后，研究人员探索了 BHB-Phe 在进食行为和体重调节中的作用。首先使用功能获得的方法来确定 BHB-Phe 是否足以减少食物摄入量和体重。对于饮食诱导肥胖（DIO）小鼠进行的初步研究，BHB-Phe 腹腔注射减少食物摄入量，而不影响运动、氧气消耗或二氧化碳的产生。另一项慢性研究证明，每日给予 DIO 小鼠 BHB-Phe 导致了每日食物摄入量的持续抑制，同时减少体重增加。
图 | BHB-Phe 可以抑制食物摄入量和体重
此外，研究团队确定了该刺激代谢通路的伸进调控机制：BHB-Phe 激活下丘脑和脑干中的神经群，发挥生理作用。研究人员使用一种活性依赖的基因标记策略（TRAP，活性群体中的靶向重组）来识别 BHB-Phe 药物给药后激活的神经元。这种实验方法能够同时在同一动物中同时识别 BHB-phe 激活（例如，TRAP+，标记为 tdTomato）和 lac-phe 激活（例如，c-Fos+）神经元。检测多个下丘脑和脑干区域的 TRAP+ 或 c-Fos+ 神经元发现，与对照组相比，BHB-Phe 和 Lac-Phe 激活多个大脑区域的神经元群，包括室旁下丘脑核（PVH）、视交叉上核（硫氰酸盐）、背内侧核（DMH）、腹内侧下丘脑核（VMH）、下丘脑弓状核（ARH）、外侧下丘脑（LH）、外侧臂旁核（LPBN）和孤立束核（NTS）等。该研究证明了 BHB-Phe 的药理学作用激活了一些下丘脑和脑干区域，其方式与 Lac-Phe 相互重叠但又有差异。
图 | 大脑中 BHB-Phe 和 lac-phe 激活神经元的 TRAP/c-Fos 映射
最后，研究团队试图了解 CNDP2 依赖的氨基酸 BHB- 酰化途径对人类的保守性。首先，我们以 BHB 和苯丙氨酸为底物，获得了重组人CNDP2，它显示出预期的体外 BHB- 酰化活性。接下来，研究者鉴定三种表达 hCNDP2 的人细胞系，并通过 CRISPR-Cas9 建立了对照和 hCNDP2-KO 细胞系，结果显示敲除 hCNDP2 导致细胞裂解液 BHB- 氨基酸合成活性几乎完全消失。这些数据表明，内源性氨基酸 BHB- 酰化活性存在于人类细胞中，主要由 CNDP2 介导。
综上所述，研究人员发现了 CNDP2 控制着 BHB 代谢的次级途径，导致刺激代谢产物 BHB- 氨基酸的生成。此外，BHB-Phe 是最丰富的 BHB- 氨基酸，是 Lac-Phe 的结构和功能同源物，可减少食物摄入量和体重。这些数据表明，BHB 的生化途径不仅超出了初级代谢中间体，还包括调节能量稳态的 BHB 衍生的信号代谢物。
这些研究结果为进一步理解人体脂肪代谢机制以及能量平衡效应提供了进一步的理论支持，并为肥胖症，酮中毒症等疾病的治疗提供了新的靶点。
