从凝胶中纯化DNA是DNA片段亚克隆过程中的关键步骤。多年以来已经发表了许多从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA的方法。
目前市场上最主流的试剂盒操作的核心步骤是将DNA结合到硅胶膜表面。含有DNA条带的琼脂糖凝胶块溶解在离散缓冲液(chaotropic buffer)中,这破坏了琼脂糖聚合物之间的氢键。解离的 DNA滞留在硅胶珠或膜上,经水溶液或含有低浓度盐或乙醇的缓冲液回收。
那么这些试剂盒的配方是如何呢?
溶胶液
异硫氰酸胍 3M
乙酸钾 0.375M
PH 5.0
漂洗液
乙酸钾 50mM
Na2EDTA·2H2O 83.5uM
PH 5.0
乙醇 80%(用时再加)
基础液:用800ml ddH2O溶解4.907g乙酸钾,加入167ul 0.5M Na2EDTA·2H2O(PH8.0)溶液,用冰醋酸调节到PH5.0,加水至1L。过滤除菌。
取200ml基础液,加入800ml乙醇。
洗脱缓冲液TE
1 M Tris-HCl (pH 8.0) 50 ml的配制:称取Tris碱6.06 g,加超纯水40 ml溶解,滴加浓HCl约2.1 ml调pH至8.0,定容至50 ml。
0.5 M EDTA(pH 8.0)50 ml的配制:称取EDTA-Na2·2H2O 9.306 g,加超纯水35 ml,剧烈搅拌,用约1 g NaOH颗粒调pH至8.0,定容至50 ml。(EDTA二钠盐需加入NaOH将pH调至接近8.0时,才会溶解。)
1×TE(10 mM Tris-HCl,pH 8.0;1 mM EDTA,pH 8.0)的配制 | |
1 M Tris-HCl(pH 8.0) | 1 ml |
0.5 M EDTA(pH 8.0) | 0.2ml |
超纯水至 | 100 ml |
以上为试剂盒溶液配方,还需要吸附DNA的柱子自行购买即可。