BCA定量后WB内参不齐，问题出在哪里？

学术 2025-01-07 09:02 天津

BCA定量后WB内参不齐可能是由多种因素引起的。以下是一些可能的原因和相应的解决方法！

BCA定量后WB内参不齐的原因：

1 样品处理不一致：确保所有样品在裂解、超声、离心等步骤中处理方式一致。取上清时也要注意不要吸到沉淀。只有蛋白液浓度均匀，取的2ul进行BCA检测才能代表真实的样品浓度，

2样本PBS洗涤：在使用PBS洗涤细胞时，一定要确保洗涤充分，避免血清中的蛋白质被BCA定量误计，这会导致WB实验中内参条带不齐。

3 上样体积不统一：统一上样体积，便于后期调整。

4 组织蛋白含量差异：组织蛋白含量大时，需要进行BCA测定，因为不同组织间蛋白含量可能存在较大差异。

5 细胞样品：对于细胞样品，保证铺板时各组细胞量差不多，资质实验员可以不需要BCA定量，看离心后收的细胞沉淀大小差不多就可以。

6 蛋白保存问题：长期保存的蛋白可能存在降解或沉淀问题，建议重新提取蛋白。反复冻融的样本也会蛋白降解。即使是煮过的蛋白，长期保存在-20℃也会逐渐降解。应尽量使用1个月内的蛋白样品，避免反复冻融。

7 蛋白与loading buffer混合问题：混合后可能存在沉淀，务必上样时避免取到沉淀。还有一个点需要注意，由于loading buffer粘稠，容易在枪头外壁粘附，特别是小体积样品更易出现误差。吸取时应尽量减少枪头浸入液面的深度，避免枪头侧面蹭到管壁。

8 蛋白定量准确性：确保BCA法测定的标准曲线R值接近0.99，以提高定量准确性。

9 内参选择：如果使用tubulin作为内参出现不齐，可以尝试更换其他内参如GAPDH

10 曝光液均匀性：在进行WB曝光时，要确保曝光液充分均匀地淋在条带上，以获得可靠的结果。如果曝光液不均匀或有干燥的地方，条带会显得较淡，影响结果的可信度。

在今天的分享中，深入探讨了BCA定量实验中可能遇到的细节问题及其解决方案。希望这些实用的技巧能够帮助大家避免实验中的常见陷阱，确保实验顺利进行。我们不仅要关注实验的每一个细节，还要不断学习和总结经验，提高自己的实验技能，在这个环节小伙伴还有需要分享的，可以留言区留言。最后，如果你觉得今天的分享对你有帮助，别忘了点赞和转发给更多的实验伙伴们。让我们一起进步，一起成长，在科研的道路上携手前行。你的每一次点赞和转发，都是对我们最大的支持和鼓励！

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