高｜浓｜度｜麦｜芽｜糊｜精
葡萄糖淀粉酶是外切酶，从非还原末端开始水解淀粉或麦芽糊精的α-1,4-糖苷键。
葡萄糖淀粉酶虽能水解α-1,6-糖苷键，但水解速度很慢，因此，支淀粉中的α-1,6-糖苷键便成了糖化过程中的主要障碍，这种阻碍作用在高浓度底物时尤其严重，一方面会影响糖化速度，另一方面会降低糖化程度以及得率，欲达到一定的糖化程度，需要相对较长的反应时间。
如果采用能较快水解α-1,6-糖苷键的普鲁兰酶与葡萄糖淀粉酶协同作用，可能会有效的水解麦芽糊精，提高糖化效率。
复合酶对高
浓度麦芽糊
精糖化的影响
01
普鲁兰酶加
酶量的优化
普鲁兰酶添加量对DE值15左右浓度为50%（w/w，以干基计）麦芽糊精糖化的影响如下图所示。
在添加50U/g葡萄糖淀粉酶的前提下，随着普鲁兰酶添加量的增加，葡萄糖得率增大，糖化程度提高；继续增加加酶量，葡萄糖得率增幅减小。
当加酶量增加到4ASPU/g时，葡萄糖得率增长趋于平缓，因此，普鲁兰酶的添加量控制在4 ASPU/g干基麦芽糊精。
普鲁兰酶加酶量对糖化过程中葡萄糖得率的影响
02
普鲁兰酶添
加方式的优化
由表可以看出，不同的加酶方式对糖化反应的葡萄糖得率有明显的影响。在开始添加50U/g葡萄糖淀粉酶的前提下，反应开始时加入全量的普鲁兰酶的葡萄糖得率最高，其次为在0h和24h分批加入，在24h时加入全量的普鲁兰酶最低。
这可能是因为反应前期体系粘度较大，水分活度低，水分流动性不好，而普鲁兰酶相比于葡萄糖淀粉酶可以迅速地水解α-1,6-糖苷键，在反应开始加入普鲁兰酶可能会提高反应速率，使得反应朝着生成葡萄糖的方向快速进行。
而在24h全量添加普鲁兰酶的体系中，粘度在葡萄糖淀粉酶前期的作用下已经有一定程度的下降，此时加入普鲁兰酶对体系粘度影响不大，故这种加酶方式效果不明显。所以加酶方式选定为0h全量添加普鲁兰酶和葡萄糖淀粉酶这种复合酶。
普鲁兰酶的添加时间和添加量与糖化液葡萄糖得率的关系
03
复合酶对糖化
初速率的影响
由图可知，在添加50U/g葡萄糖淀粉酶的前提下，添加一定量的普鲁兰酶可以提高反应初速率。
只加葡萄糖淀粉酶的空白反应初速率为1.8 g/(L·min)，同时加入葡 萄糖淀粉酶和4ASPU/g普鲁兰酶的试验组反应初速率比空白提高了18.8%，这可能与加入普鲁兰酶会降低反应体系粘度有关。
由于添加适量的普鲁兰酶会明显提高初始反应速率，而对葡萄糖得率影响不明显，因此可以考虑用复合酶糖化来缩短糖化时间。
普鲁兰酶加酶量（ASPU/g）
普鲁兰酶加酶量对糖化初速率的影响
04
复合酶处理对糖
化反应过程的影响
由图可以看出，复合酶处理后，糖化前期反应速率明显提高。
到糖化24 h时，复合酶处理组的葡萄糖得率高于空白48 h时的葡萄糖得率，说明复合酶法可以缩 短糖化反应时间24h左右。而糖化24h后，复合酶处理的葡萄糖得率增加缓慢，最终葡糖糖得率比空白高了4.5%，糖化效果比超声波处理更好。这可能与复合酶能迅速水解α-1,6-糖苷键，分解极限糊精，并且改变体系粘度有关。
复合酶处理对糖化过程的影响
05
普鲁兰酶的作用模式
普鲁兰是由出芽短梗霉产生的胞外多糖，主要是以α-1,6-糖苷键结合麦芽糖构成同型多糖（结构见图3-18），即葡萄糖通过α-1,4-糖苷键结合成麦芽三糖，两端与另外的麦芽三糖再以α-1,6-糖苷键结合，如此反复连接形成高分子多糖。
按照作用位点的不 同，普鲁兰酶可以分为Ⅰ型普鲁兰酶与Ⅱ型普鲁兰酶。
Ⅰ型普鲁兰酶(EC 3.2.1.41) 又称为脱支酶、限制性糊精酶或支链淀粉-6-葡聚糖水解酶，只能水解淀粉和多糖的α- 1,6-糖苷键。
Ⅱ型普鲁兰酶(EC 3.2.1.135)不但能够水解α-1,6-糖苷键，而且能水解低聚糖的α-1,4-糖苷键，同时具备脱支酶和α-淀粉酶两种酶的活性。
普鲁兰糖的结构式
由图可以看出，将普鲁兰用本试验中的普鲁兰酶充分水解后，几乎全部生成麦芽三糖，说明此酶是Ⅰ型普鲁兰酶，此类型酶的作用位点专一，效率更高，可以广泛的应用于淀粉糖工业。
普鲁兰酶转化普鲁兰糖产物的HPLC图
06
普鲁兰酶加速
糖化反应机理
采用糊化的玉米淀粉乳为底物，在60℃分别加入葡萄糖淀粉酶和普鲁兰酶，对其降粘效果进行了比较。
为了更好的模拟糖化反应体系，葡萄糖淀粉酶加酶量为50 U/g，普鲁兰酶加酶量为4ASPU/g，保证了两种酶的加酶量与之前试验一致。
由图可以看出，葡萄糖淀粉酶和普鲁兰酶都可以明显的降低玉米淀粉乳的粘度。普鲁兰酶降粘速率开始时很快，粘度下降到一定程度后趋于平缓，120min时仅为原淀粉的6.6%，而葡萄糖淀粉酶降粘速率比较稳定，随着酶解的进行也会有比较好的降粘效果，120min时粘度为原淀粉的18.9%。
葡萄糖淀粉酶水解α-1,4-糖苷键的速率约为α-1,6-糖苷键的500倍，从麦芽糊精非还原末端 附近水解到分支点附近时，水解速率会降低，成为糖化反应开始阶段的限制因素；普鲁兰酶可以水解分支点的α-1,6-糖苷键。
因此，在反应开始阶段全量添加普鲁兰酶可以提前把麦芽糊精脱支，迅速降低体系粘度，有利于葡萄糖淀粉酶高速的水解α-1,4-糖苷键，提高糖化速率和葡萄糖得率。
两种淀粉酶降粘效果比较
07
复合酶对麦芽糊精
糖化过程粘度的影响
DE值15左右浓度为50%的麦芽糊精糖化（空白组添加了50U/g葡萄糖淀粉酶） 过程的粘度曲线如图所示。
由图可以看出，复合酶处理后，糖化前期麦芽糊 精粘度下降很快。反应6h时粘度仅为空白的60.8%，粘度的下降使得反应前期糖化反应速率提高，但复合酶降粘效果不如超声明显；糖化24 h以后，添加复合酶的糖化液粘度与空白接近，此时糖化反应受粘度影响较小，复合反应成为糖化反应的主要抑制因素。
复合酶对糖化过程中粘度的影响
高浓度麦芽糊精
的糖化产物分析
01
糖化过程的复合反应
如图所示，麦芽糊精在糖化时同时发生正向反应和复合反应。
葡萄糖淀粉酶会催化葡萄糖发生复合反应，这种反应在底物浓度较高时尤为严重。
以葡萄糖为底物，添加葡萄糖淀粉酶得到的DP2和DP3的糖主要是含有α-1,6-糖苷键的异麦芽糖和潘糖，而麦芽糖和麦芽三糖在同一DP值中含量较少。
复合反应的副产物化学结构式如图所示，采用氨基柱可以很好的分离这些低聚糖（标样的HPLC色谱图如图所示）。
糖化方程（a为正向反应；b为复合反应）
糖化反应副产物
低聚糖标准品HPLC图（图中，从左到右依次为葡萄糖、麦芽糖、异麦芽糖、麦芽三糖、潘糖、异麦芽三糖）
02
葡萄糖浓度对
复合反应的影响
为了更好的了解葡萄糖浓度对复合反应的影响程度，排除麦芽糊精中其他低聚糖的干扰，试验以葡萄糖为底物，研究了其浓度对复合反应的影响。
由表可以看出，以葡萄糖为底物，按一定比例添加的葡萄糖淀粉酶，随着底物浓度的提高，复合反应产生的低聚糖比例会增加，而葡萄糖比例降低。
当葡萄糖浓度为10%~30%时，复合反应只会生成麦芽糖和异麦芽糖；当葡萄糖浓度为40%时，复合反应除了生成麦芽糖和异麦芽糖，还会产生少量潘糖；当葡萄糖浓度为50%~60%时，复合反应会生成麦芽糖、异麦芽糖、麦芽三糖、潘糖和异麦芽三糖，这是因为在葡萄糖淀粉酶的催化下，葡萄糖分子之间会脱去一分子水，通过α-1,4-糖苷键生成麦芽糖或者α-1,6-糖苷键生成异麦芽糖，生成的异麦芽糖和葡萄糖之间也会通过α-1,6-糖苷键生成异麦芽三糖或者α-1,4-糖苷键生成潘糖。
由于高浓度麦芽糊精水解到后期会产生高浓度的葡萄糖，因此可以推测高浓度麦芽糊精糖化后期也会产生较多的低聚糖 等副产物。
葡萄糖复合反应产物分析
单酶法中底物浓度
对麦芽糊精
糖化产物组成的影响
虽然理论上葡萄糖淀粉酶可以水解麦芽糊精中所有的糖苷键，但由于复合反应的存在，D-葡萄糖的比例很难超过95%。
为了探究底物浓度对这种复合反应的影响， 选取DE值15左右的麦芽糊精为底物，添加一定比例的葡萄糖淀粉酶，分析反应48h后糖化产物。
浓度对麦芽糊精糖化产物组成的影响如表所示。
由表可知，随着麦芽糊精浓度的增加，葡萄糖比例呈现先增加后降低的趋势，麦芽糖、异麦芽糖、麦芽三糖、潘糖都呈逐渐增加的趋势，而水解液中未出现异麦芽三糖。
当浓度为10%时，产物只有葡萄糖和麦芽糖，麦芽糖比例达到8.46%，这是由于麦芽糊精浓度太低时水解不完全，水解产生的麦芽糖没有进一步转化为葡萄糖。
当浓度为20%时，产物也只有葡萄糖和麦芽糖，麦芽糖比例比10%时明显降低，这是因为20%浓度麦芽糊精分子密度较大，且此浓度下反应体系粘度和水分活度对糖化反应影响不大，因此产物纯度较高。
当浓度为30%时，产物除了葡萄糖、麦芽糖，还出现了异麦芽糖，原因是随着麦芽糊精浓度的升高，糖化产生的葡萄糖浓度也会提高，高浓度的葡萄糖在葡萄糖淀粉酶的催化下会发生复合反应，通过α-1,6-糖苷键生成异麦芽糖。
当浓度为40%时，产 物中有葡萄糖、麦芽糖、异麦芽糖，另外会产生潘糖，这是因为随着麦芽糊精浓度的提高，产物葡萄糖和复合反应产生的异麦芽糖通过α-1,4-糖苷键生成潘糖。
当浓度为50%时，产物中有葡萄糖、麦芽糖、异麦芽糖、潘糖。
当浓度为60%时，产物中有葡萄糖、麦芽糖、异麦芽糖、潘糖，另外会产生麦芽三糖。
浓度过低和过高都会使得葡萄糖比例降低，浓度为20%~50%时葡萄糖所占比例接近，当浓度为60%时葡萄糖所占比例明显降低，这也与之前50%为极限糖化浓度结论一致。
所以综合考虑，糖化的极限最佳浓度为50%。
麦芽糊精糖化产物分析
