摘要:嵌合抗原受体（CAR）-T细胞过继免疫疗法是一种有前景的癌症治疗方法，它利用基因工程化的T细胞攻击肿瘤。然而，这种疗法可能会有一些不良反应。来源于CAR-T细胞的外泌体是CAR-T细胞的潜在替代品，可能克服一些限制。外泌体是细胞释放的小囊泡，可以携带多种分子，包括蛋白质、RNA和DNA。它们在细胞间通讯中扮演重要角色，并且可以用来向癌细胞输送治疗剂。应用来源于CAR-T细胞的外泌体可以使CAR-T细胞疗法在临床上更加可控和有效。外泌体是无细胞的，这意味着它们比CAR-T细胞更不可能引起不良反应。CAR-T细胞和外泌体的结合可能比单独任一疗法更有效地治疗癌症。外泌体可以向CAR-T细胞无法到达的癌细胞输送治疗剂。适当应用细胞和外泌体平台可以使CAR-T细胞疗法成为更实用的癌症治疗方法。这种组合疗法可以为治疗多种癌症提供一种安全有效的方式。
1.引言
近年来，癌症免疫疗法已成为主要的治疗选择之一。其中最有前景的方法之一是嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法，该疗法涉及工程化T细胞以靶向特定的癌细胞。然而，CAR-T细胞疗法也可能产生一些不良反应，如细胞因子释放综合征（CRS）。CRS的特点是细胞因子的快速和过量释放，导致细胞因子风暴。当大量的促炎和炎症细胞因子，如白细胞介素-2（IL-2）、可溶性IL-2受体α（可溶性IL-2Rα）、干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、可溶性IL-6R和粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）被释放到血液中时，就会发生细胞因子风暴。细胞因子风暴触发免疫反应，引起广泛的炎症和免疫细胞的激活。这种免疫超激活可能会攻击重要器官，包括肺、肝、肾、心、脑和中枢神经系统。外泌体是体内许多细胞分泌的一种细胞外囊泡。它们已被证明在细胞间通讯中发挥作用，并且可能能够向癌细胞输送治疗性货物。使用来源于CAR-T细胞的外泌体作为一种治疗方法，可能会提供更多的治疗过程控制，并帮助降低不良反应的风险。外泌体是癌症免疫疗法中的一个有前景的新研究点，它们有可能彻底改变癌症的治疗方法。本综述聚焦于CAR-T细胞和来源于CAR-T细胞的外泌体在癌症模型中的治疗潜力。
2.外泌体概述（内容、生物合成和摄取）
细胞外囊泡（EVs）的分类主要分为两大类：外泌体和外泌体。外泌体通过质膜的外向出芽形成，形成大小范围约为50纳米至1微米的微囊泡，而内源性的外泌体则来源于内质网，其大小范围为40纳米至约160纳米（平均约100纳米）。多年来，已确定这两种外泌体分类在生理和病理上都发挥作用。但在过去十年中，越来越多的证据表明，膜囊泡是细胞间通讯中的重要信使。外泌体是这些囊泡中最被研究和特征明确的。外泌体通过质膜的双重内陷形成。首先，内陷形成一个杯状结构，从早期分选内质体（ESEs）开始，它们通过跨高尔基体网络和内质网的贡献成熟为晚期分选内质体（LSEs），随后，内质膜的内陷形成含有腔内囊泡（ILVs，未来的外泌体）的多囊泡体（MVBs）。最终，外泌体将通过MVB与质膜的融合被释放（图1）。由于大小差异、内容、细胞起源和在受体细胞中的功能，外泌体是异质的。它们的大小异质性来自于外泌体内容物在MVBs中的不均匀内陷。外泌体的内容物可能因其功能而异；通常，外泌体具有以下货物：膜蛋白、细胞质和核蛋白，以及细胞外基质和核酸，如mRNA、非编码RNA种类和DNA。它们对受体细胞的作用和影响也可能因细胞表面受体而异，可以诱导细胞存活、凋亡和免疫调节。关于外泌体，异质性也可以由它们的细胞起源引起。外泌体的摄取与多种机制有关，如依赖于clathrin的内吞作用、吞噬作用和微囊泡吞噬作用。外泌体具有多种表面分子，使它们能够与许多受体细胞相互作用。这意味着外泌体可以向不同细胞传递多种信号，或者在细胞上没有生理功能，仅作为营养水平的放大器。
3.外泌体的生物学功能
如前所述，外泌体具有生理和病理属性。它们可以携带多种分子，包括microRNAs、mRNAs和蛋白质。外泌体可以将这些分子传递给其他细胞，这些细胞随后可以使用它们来改变它们的行为。这个过程被称为外泌体介导的细胞间通讯。外泌体可以与近邻的细胞通讯，也可以通过血液循环与身体其他部位的细胞通讯。外泌体甚至可以通过血脑屏障，该屏障将血液与大脑分开。有报道称，外泌体是细胞间相互通讯的多功能方式。它们可以同时传递多个信号，并且可以针对多个细胞和多个位置。这使得外泌体成为细胞间通讯的强大工具。外泌体是一个迅速发展的研究领域。科学家们仍在了解它们的许多功能。然而，很明显，外泌体在细胞间通讯和许多其他生物过程中发挥着重要作用。
美国食品药品监督管理局批准了CAR-T细胞疗法作为第一种基因疗法。表达嵌合抗原受体（CAR）的基因工程T细胞作为一种有前途的新疗法，正在迅速崛起，用于治疗血液学和非血液学恶性肿瘤。在实体瘤中，CAR-T疗法并未取得在血液学恶性肿瘤中观察到的临床成功。基于CAR的过继免疫疗法使用基因修饰的T淋巴细胞提供肿瘤靶向和免疫反应，可以作为活体药物，对目标细胞进行持续的细胞毒性攻击。CAR-T细胞及其在体内的复制可以增强细胞因子释放，这不容易控制。这种效应是潜在的副作用来源，如CRS（细胞因子释放综合征）、细胞因子风暴和靶向肿瘤外的反应。
3.1.实体瘤癌症
CAR-T细胞疗法彻底改变了癌症治疗领域，特别是在血液学恶性肿瘤的管理中。然而，其在实体瘤中的应用由于肿瘤微环境的复杂性，如异质性和恶劣的肿瘤微环境，提出了独特的挑战。在目标识别、增强肿瘤渗透、管理毒性和探索联合疗法方面的进展，为CAR-T细胞疗法在抗击实体瘤中的有效使用带来了希望，使我们更接近个性化和精确的癌症治疗。
目标选择确实是CAR-T细胞疗法在实体瘤中的一个重要障碍。实体瘤组织复杂的性质和不同肿瘤细胞中蛋白质表达谱的变异性，使得识别能够有效覆盖所有肿瘤细胞的目标变得具有挑战性。即使抗原阳性的肿瘤细胞被消除，仍有大量抗原阴性细胞可能持续存在，导致肿瘤复发率高。
实体瘤目标选择的困难之一是实体瘤细胞源自健康组织。许多在肿瘤细胞中高度表达的抗原也在正常细胞中少量表达。这在避免非特异性杀伤健康细胞方面提出了挑战，导致靶向肿瘤外的副作用。肿瘤异质性是CAR-T细胞疗法在实体瘤中的另一个重大挑战。实体瘤通常表现出高水平的异质性，意味着同一患者内的不同肿瘤细胞可能不表达相同的肿瘤相关抗原。因此，如果CAR-T细胞识别单一目标来治疗实体瘤，疗法的成功可能取决于肿瘤的异质性。
CD133，一种新的肿瘤干细胞标记物，已被确定为在许多实体瘤中过表达的目标，并正在作为CAR-T细胞疗法的目标进行探索。然而，实体瘤的高度异质性使得其治疗比血液学恶性肿瘤更具挑战性。关键挑战在于选择能够有效解决实体瘤异质性和复杂性的目标。
已观察到CAR-T细胞返回淋巴和血液系统，增加了遇到血液肿瘤细胞的可能性。CAR-T细胞疗法在实体瘤中的成功取决于其穿透肿瘤组织通过血管内皮细胞的能力。
CAR-T细胞进入实体瘤的有限迁移和侵袭可以归因于肿瘤微环境中存在的密集纤维化基质和促进T细胞渗透到肿瘤组织中的趋化因子的下调。
实体瘤中恶劣的免疫抑制肿瘤微环境进一步复杂化了CAR-T细胞疗法。肿瘤微环境（TME）是一个复杂的环境，由各种细胞外基质、基质细胞、炎症细胞和血管组成。在实体瘤中，TME的特点是血管化低、缺氧和细胞外基质浓度高。有几个因素促成了免疫抑制TME，对CAR-T细胞疗法提出了重大挑战。实体瘤通常表现出酸性TME，这是由于增加的糖酵解和乳酸产生。低pH值抑制T细胞功能，并通过损害CAR-T细胞活性和细胞因子产生促进免疫逃逸。
在实体瘤中，TME的特点是难以获得色氨酸，这是一种对T细胞最佳功能至关重要的必需氨基酸。肿瘤细胞和免疫抑制细胞，如骨髓源性抑制细胞（MDSCs），可以通过酶色氨酸2,3-双加氧酶（IDO）消耗色氨酸，导致T细胞抑制。实体瘤通常在TME中有低氧水平（缺氧）区域。缺氧可以损害CAR-T细胞的功能和存活，降低其靶向肿瘤细胞的有效性。TME中的免疫抑制细胞，如调节性T细胞（Tregs）、MDSCs和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），分泌免疫抑制分子如转化生长因子-β（TGF-β）、白介素-10（IL-10）和程序性细胞死亡配体1（PD-L1）。这些分子抑制CAR-T细胞活性，抑制免疫反应，并促进肿瘤免疫逃逸。
这些因素共同在实体瘤内创造了一个免疫抑制和恶劣的环境，阻碍了CAR-T细胞疗法的效力。克服这些挑战是研究的重点，涉及增强CAR-T细胞持久性、调节TME和将CAR-T疗法与其他免疫调节方法相结合的策略，以改善实体瘤的治疗结果。
3.2.肺癌治疗
肺癌确实是全球最普遍且致死率最高的癌症之一。不幸的是，大部分肺癌患者在晚期才被诊断出，此时治疗选择有限，导致5年生存率大约只有10-20%。尽管外科切除结合辅助治疗仍是主要的治疗策略，但只有少数患者符合手术条件，手术后的复发仍是一个重大问题。因此，迫切需要探索新的治疗策略，以阻止肿瘤进展并改善肺癌患者的生存结果。
CAR-T细胞疗法在血液恶性肿瘤中已证明成功，为治疗实体瘤，包括肺癌，提供了新的希望。然而，它面临着与其他实体瘤相似的挑战，如前所述。此外，CAR-T细胞的临床应用受到肿瘤溶解综合征、神经毒性综合征和细胞因子释放综合征等挑战的阻碍。
根据提供的信息，对于患有肺癌的患者，有一系列潜在的肿瘤相关抗原（TAAs）可用于CAR-T细胞疗法。值得注意的是，选择CAR-T细胞疗法的最佳TAA取决于多种因素，包括肿瘤的特定特征及其微环境。需要进一步的研究和临床试验来确定在CAR-T细胞疗法中针对这些TAAs的疗效和安全性：
表皮生长因子受体（EGFR）是一种在实体瘤中经常过表达的蛋白质，包括肺癌和脑转移。EGFRvIII是EGFR的一种变体，在肺癌中尤为常见。针对EGFRvIII工程化的CAR-T细胞已被证明能有效杀死EGFRvIII阳性的肺癌细胞。这可能是预防手术后肺癌复发和转移的潜在治疗策略。
间皮素（MSLN）是一种细胞粘附糖蛋白，与肺癌患者的高肿瘤侵袭性和预后不良相关。它被认为是包括肺癌在内的实体瘤CAR-T疗法的理想靶点。
黏蛋白1（MUC1）是一种跨膜蛋白，涉及癌细胞粘附和转移。与正常肺组织相比，MUC1在肺癌组织中的表达显著更高。它是肺癌CAR-T细胞疗法的潜在靶点。
人表皮生长因子受体2（HER2）在肺癌中高度表达。它促进癌细胞的增殖、侵袭和血管生成。HER2可以作为肺癌诊断和治疗的有希望的生物标志物。
3.3.乳腺癌
乳腺癌目前在全球女性癌症中的发病率和死亡率最高。现有治疗的耐药性出现，强调了开发新疗法的必要性。CAR-T细胞疗法是一种利用患者免疫细胞对抗癌症的免疫疗法，已显示出前景，并已广泛应用于血液恶性肿瘤。其在治疗实体瘤，包括乳腺癌中的应用势头增强。在乳腺癌细胞中，已鉴定出表达改变的特定分子作为CAR-T细胞疗法的潜在靶点。十九种抗原，即HER2、EGFR、肝细胞生长因子受体/间充质-上皮转化因子（HGFR/cMET）、酪氨酸蛋白激酶跨膜受体（ROR1）、AXL受体酪氨酸激酶（AXL）、MUC1、MSLN、CD70、CD133、CD44v6、上皮细胞粘附分子（EpCAM）、软骨素硫酸蛋白聚糖4（CSGP4）、细胞间粘附分子1（ICAM1）、肿瘤内皮标记8（TEM8）、滋养层细胞表面抗原2（TROP2）、叶酸受体α（FRα）、自然杀伤组2成员D（NKG2D）、GD2和癌胚抗原（CEA），已作为乳腺癌CAR-T细胞疗法的靶点进行研究。这些抗原大多属于受体酪氨酸激酶家族和细胞表面蛋白。研究表明，所有19种抗原都显示出抗肿瘤效应，抑制肿瘤生长并诱导促炎细胞因子的释放。
尽管近年来CAR-T细胞疗法取得了进展，但仍存在几项挑战，包括不充分的转移和渗透、免疫抑制环境的存在、缺乏肿瘤特异性或肿瘤相关抗原以及CAR-T细胞毒性。
尽管CAR-T细胞疗法在乳腺癌方面取得了显著进展，但由于支持证据不足，其在临床设置中的应用仍相距甚远。为了加快CAR-T细胞疗法在乳腺癌患者中的临床实施，外泌体疗法和临床试验对于解决安全问题和克服现有挑战至关重要。
3.4.血液学和非霍奇金淋巴瘤（NHL）治疗
CAR-T细胞免疫疗法在治疗血液恶性肿瘤方面取得了显著成功，在临床试验中观察到高缓解率。针对CD19的CAR-T细胞显示出对耐药性B细胞恶性肿瘤的持久缓解效果，复发和难治性急性B淋巴细胞性白血病的治愈率已达到大约80-90%。
CAR-T疗法在血液恶性肿瘤，如急性淋巴细胞性白血病和大B细胞淋巴瘤中的成功，彻底改变了它们的治疗。FDA批准针对CD19的CAR-T细胞用于治疗复发或难治性儿童和年轻成人弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL），进一步验证了这种方法的有效性。
CAR-T细胞疗法在血液恶性肿瘤中的成功关键因素之一是存在单克隆疾病，其中单一靶抗原（如CD19）表达在所有肿瘤细胞表面。这使得CAR-T细胞能够有效地靶向并消除癌细胞。为了克服这些挑战，未来针对肿瘤的治疗策略可能会涉及将基于免疫疗法的治疗，如CAR-T细胞疗法，与其他治疗方式相结合。
非霍奇金淋巴瘤（NHL）美国食品药品监督管理局（FDA）最近批准的CD19特异性CAR-T细胞疗法为化疗耐药性B细胞非霍奇金淋巴瘤（NHL）和复发/难治性儿童及年轻成人弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）提供了有希望的治疗。CD19是一个泛B细胞标记，在大多数B细胞NHL中高度表达，使其成为这些恶性肿瘤中CAR-T细胞疗法的合适靶点。在急性淋巴细胞性白血病（ALL）的情况下，针对CD19的CAR-T细胞的临床效果似乎比淋巴瘤更显著。这可能是由于疾病生物学和治疗反应的差异。另一方面，外周T细胞淋巴瘤患者呈现一组异质性疾病，通常预后较差，这对CAR-T细胞疗法构成了挑战。
CAR-T细胞疗法已从第一代发展到第二代CAR-T细胞。第一代CAR-T细胞使用CD3z链作为信号域，而第二代CAR-T细胞增加了额外的共刺激域以增强其抗肿瘤活性。第二代CAR-T细胞疗法显示出更显著的抗白血病反应，在复发B细胞ALL患者中高恢复率达到90%。然而，在具有高风险特征的个体中，如早期复发、难治性疾病和某些类型的淋巴瘤，治疗结果仍然不佳。
目前，针对CD19的CAR-T细胞在约40%的化疗耐药性DLBCL、高级别B细胞淋巴瘤（HGBCL）和未经前期治疗的原发性纵隔B细胞淋巴瘤（PMBCL）患者中显示出持续的缓解率。这些产品也用于至少经过两线前期治疗后复发的侵袭性淋巴瘤患者。CAR-T细胞疗法的进步为治疗NHL患者提供了高效的解决方案。
3.5.前列腺癌
尽管在转移性前列腺癌（mPCa）中使用CAR-T细胞疗法的研究有限，但已对这种情况下CAR-T细胞疗法的潜在靶点进行了研究。两个重要的CAR-T细胞靶向抗原候选者是前列腺特异性膜抗原（PSMA）和前列腺干细胞抗原（PSCA）。体外和体内模型表明PSMA-CAR-T细胞可以增殖并识别PSMA阳性细胞。第二代CAR-T细胞显示出比前几代更好的杀伤效果，代表了mPCa的一种新的免疫靶向方法。
在前列腺癌（PCa）中，已确定几种蛋白质由恶性细胞优先表达，包括前列腺特异性抗原（PSA）、前列腺酸性磷酸酶（PAP）、前列腺干细胞抗原（PSCA）、T细胞受体γ替代阅读框蛋白（TARP）、瞬时受体电位（trp）-p8和前列腺特异性膜抗原（PSMA）。最近，各种研究探索了这些前列腺肿瘤相关抗原（TAAs）作为在PCa患者中诱导免疫反应的靶点。
总的来说，转移性前列腺癌中CAR-T细胞疗法的使用是一个积极研究的领域，虽然已经获得了有希望的临床前结果，但需要进一步调查以评估这种方法在临床设置中的安全性和有效性。
3.6.胶质母细胞瘤
外泌体的使用为CAR-T细胞技术在实体瘤治疗中的应用，包括针对特定区域的肿瘤，如胶质母细胞瘤（GBM），带来了希望。虽然CAR-T细胞疗法在GBM中的探索还处于早期阶段，但初步结果已经显示出使用这种方法的可行性、安全性甚至疗效迹象。
在CAR-T细胞疗法进一步开发用于GBM时，需要解决的几个挑战包括增强CAR T细胞对肿瘤的渗透、优化输注剂量和频率、调节免疫抑制性肿瘤微环境，以及解决GBM固有的分子异质性。此外，与GBM的免疫疗法相关的一般挑战，如管理合并类固醇使用、区分真正的肿瘤进展与放射影像假进展，以及识别潜在的反应生物标志物，需要在任何CAR-T细胞研究中考虑和解决。GBM的初始CAR靶标，如IL-13 Rα2、EGFRvIII和HER2，只是正在探索用于该疾病CAR靶向的潜在抗原的一些例子。针对ephrin-A2和EGFR的CAR-T细胞的临床调查正在进行中，最近发现了新的抗原，如CD70。这些研究和其他研究的结果备受期待，以进一步推进我们对GBM CAR-T细胞疗法的理解。
总之，尽管存在需要克服的挑战，但早期结果已经显示出CAR-T细胞疗法在GBM中的前景。正在进行的临床调查和探索新的抗原作为CAR靶点为这一具有挑战性的疾病提供了改善疗法的希望。
3.7.CAR-T细胞和溶瘤病毒治疗
CAR-T细胞和溶瘤病毒（OVs）已显示出针对血液和实体肿瘤的潜力。然而，作为单一疗法，它们的效果有限，特别是在实体肿瘤的情况下。为了应对这一挑战，癌症基因治疗领域一直在专注于开发包括化疗、放疗和其他免疫疗法（如免疫检查点抑制剂ICIs）在内的联合治疗策略。
将CAR-T细胞和OVs结合起来可能改善各种类型癌症患者的治疗结果。通过整合两种方法的优势，有潜力增强肿瘤靶向、免疫激活和治疗效果。然而，需要进一步的研究和临床试验来评估这些联合策略在更广泛的癌症类型和患者群体中的安全性、可行性和有效性。
3.8.CAR-T细胞疗法的局限性
确实，为了充分发挥CAR-T细胞疗法的潜力，需要解决几个挑战。其中一些挑战包括理解肿瘤微环境。宿主肿瘤微环境在调节免疫反应中起着关键作用，可能影响CAR-T细胞疗法的效果。另一个挑战是扩大CAR-T疗法的适用性，因为需要使CAR-T疗法可用于治疗更广泛的人类癌症。这涉及识别和测试新抗原以及优化CAR设计以针对特定类型的癌症。此外，CAR-T疗法目前成本高昂，对许多患者来说可能负担不起。解决CAR-T细胞疗法的定价和可负担性问题是确保更广泛获取和可用性的关键。管理副作用是另一个问题；CAR-T细胞疗法可能与副作用相关，如CRS、高烧、窦性心动过速、低血压、低氧、神经毒性、心脏功能抑制、其他器官功能障碍和移植物抗宿主病（GVHD）。需要开发管理这些副作用的策略以提高患者安全和治疗效果。
CAR-T细胞可能会经历耗竭和衰老，导致功能减弱和疗效降低。理解和解决T细胞耗竭对于最大化CAR-T细胞疗法的长期效果至关重要。
增强对免疫检查点阻断的反应在癌症治疗中很重要。耗竭的T细胞可能会抑制效应免疫并降低对免疫检查点阻断疗法的反应性。检查点阻断疗法通过靶向调节T细胞反应的免疫检查点，在癌症治疗中取得了重大突破。一项研究探讨了免疫检查点阻断的重要性以及耗竭T细胞在抑制效应T细胞中的作用。这项研究重点关注了耗竭T细胞、针对程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）的免疫检查点阻断和激进癌症干细胞（CSCs）的产生和维持之间的关系。CSCs是肿瘤内具有自我更新和肿瘤启动能力的一小部分细胞，有助于肿瘤生长和治疗抵抗。作者证明，对PD-1阻断无反应的终末耗竭CD8+T细胞在促进激进CSCs的产生和维持中扮演了重要角色。他们发现，肿瘤微环境中耗竭CD8+T细胞的存在导致CSCs上免疫检查点分子（如PD-L1）的表达增加。这种耗竭T细胞和CSCs之间的相互作用导致效应T细胞活性的抑制和增强CSC干细胞特性。
需要探索克服T细胞耗竭和增强对免疫检查点抑制剂反应的策略，以改善联合疗法的结果。
应对这些挑战将需要科学家、临床医生和行业合作伙伴之间的持续研究、创新和合作。尽管存在这些挑战，对CAR-T细胞疗法的日益增长的知识提供了宝贵的见解，可以指导该领域的进一步改进和进步。
4.CAR-T细胞衍生的外泌体的优势
CAR-T细胞疗法存在局限性，包括强烈的毒性、抗原逃逸和肿瘤浸润的限制。然而，CAR-T细胞衍生的外泌体（EVs）提供了一种更安全且潜在有效的免疫疗法选择，在癌症研究中引起了兴趣。这些外泌体可以定制携带各种货物，如针对肿瘤的受体、小干扰RNA（siRNAs）或细胞因子，这些物质增强了抗癌效果。CAR T细胞衍生的细胞外囊泡（EVs）的显著益处包括安全性（无细胞性质）、易于修改、可检测性和癌症的特异性。以下段落将进一步解释这一点，并在表1中描述。
4.1.更可控的条件
与输注CAR表达T细胞相关的最严重的副作用之一是CAR-T细胞诱导的CRS。CRS的症状包括恶心、头痛、心动过速、低血压、皮疹和呼吸急促。这些症状是由免疫细胞分泌细胞因子引起的。细胞因子风暴是一种严重的CRS，经常导致低血压和高烧，最终可能导致器官衰竭甚至死亡。几乎三分之二的CAR-T细胞患者经历了CRS，通常出现在细胞输注后10天。在最初的CAR-T细胞临床试验中，有两例报告的死亡。这种潜在致命的后果主要与CAR-T细胞不受控制的细胞因子分泌有关。首先，由大量输注的抗肿瘤淋巴细胞（高达10^11）释放的细胞因子引起的全身性炎症反应类似于脓毒症。如果细胞因子风暴导致心律失常、心脏骤停、肝衰竭或肾衰竭，接受者的生命可能处于危险之中。其次，CAR-T细胞可能会失控扩张，并表现为“活性药物”，导致CRS。第二代和第三代CAR结构中成本刺激受体如CD28、4-1BB、DPA10、OX40或ICOS的作用显著提高了反复抗原暴露后的绝对T细胞增殖。例如，在慢性淋巴细胞性白血病患者中，4-1BB整合的CD19 CAR-T细胞在给药后可以增殖超过1000倍。CAR-T细胞的体内扩张被认为是必不可少的，并且与毒性和反应有关。在重症监护室中，类固醇、升压药和IL-6阻断剂以及支持性治疗都已成功用于解决CRS相关问题。与传统药物引起的副作用不同，CAR-T细胞引起的毒性不能仅通过减少药物剂量来控制。研究人员尝试在CAR中加入自杀基因作为安全开关，以在极度毒性的情况下消除CAR-T细胞。这种策略涉及工程化CAR-T细胞，使其具有自杀基因，当出现不良反应时可以激活以诱导细胞死亡。包括这个安全开关，允许及时和控制性地消除CAR-T细胞，最小化对患者的潜在伤害。CAR-T细胞衍生的外泌体有潜力被用作对癌细胞的直接攻击，使这些“活性药物”更容易控制。这是因为外泌体具有与CAR-T细胞相同的生物学特性。CAR-T细胞衍生的外泌体可以通过直接攻击肿瘤来控制CAR-T细胞诱导的毒性，并取代对免疫细胞的需求（图2）。Zitvogel及其同事的初步研究提供了这一理论。在他们的体内研究中，用肿瘤肽脉冲的小鼠DC产生的外泌体导致了现有肿瘤的排斥。体外，DC产生的外泌体在诱导抗肿瘤免疫反应方面与具有相似数量的DCs（0.5×10^6至1×10^6 DCs）的细胞一样有效。Peters等人的早期研究表明，人类T细胞产生的外泌体在细胞毒性T淋巴细胞（CTL）与其靶细胞之间的相互作用中至关重要。CTL的表面膜分子，如T细胞受体（TCR）、CD3和CD8，存在于CTL衍生的外泌体中。这些分子允许外泌体特异性地靶向和杀死肿瘤细胞。当外泌体与肿瘤细胞结合时，外泌体上的TCR与肿瘤细胞的抗原/MHC复合物相互作用。这种相互作用触发了外泌体与肿瘤细胞之间的共轭形成。然后共轭对外泌体和肿瘤细胞传递致命一击，导致其死亡。外泌体对外泌体靶向的肿瘤细胞传递的致命一击是由蛋白质和其他分子的释放引起的，包括穿孔素、颗粒酶和溶酶体酶。TCR激活刺激了CTL衍生的外泌体的产生，类似的工作已经证明TCR/CD3复合物存在于人类CTL衍生的外泌体的膜中。
与CAR-T细胞相比，CAR-T EVs和外泌体显示出更低的毒性潜力。这使它们适合作为无细胞免疫疗法剂，这可能简化了监管批准，因为它们可能不被归类为先进治疗药物产品。此外，CAR-T外泌体具有低免疫原性，允许它们在第三方环境中作为现成产品使用。与亲代细胞不同，EVs和外泌体可以轻松穿透肿瘤屏障，即使是在具有显著纤维反应的肿瘤中。研究表明，通过刺激生产细胞可以提高EV的产生和功能。在自体CAR生产中使用CAR-T EV疗法消除了将肿瘤细胞重新引入患者的风险，这是CAR-T细胞疗法的一个担忧。已经观察到，残留的肿瘤细胞可能无意中获得CAR表达，导致对CAR-T细胞疗法产生抗药性。来自T淋巴细胞的EVs表达TCR和促凋亡分子，赋予它们细胞毒性和抗原特异性。这表明CAR-T细胞衍生的EVs可以有效传递促凋亡信号到癌细胞。然而，CAR分子在CAR-T细胞衍生的EVs上的存在对于诱导特定的癌细胞死亡至关重要，类似于它们的亲代CAR-T细胞。通过优化外泌体的释放和表面CAR的表达，可以提高CAR表达外泌体的产生。TCR激活已被证明可以增加CTL衍生的外泌体的产生。另一方面，通过各种抗原刺激技术可以实现外泌体上更高水平的CAR表达。这些包括使用涂有重组CAR靶抗原的细胞珠或使用表达CAR抗原的细胞。这些策略可以帮助提高CAR表达外泌体产生的效果和效率。
尽管对CAR-T细胞衍生的外泌体的全面理解仍在研究中，但它们极有可能将抗原靶向的细胞毒性传递给癌细胞。这是因为它们表面含有可以与癌细胞结合的靶向分子，以及可以杀死癌细胞的细胞毒性分子。
4.2.直接攻击者
CAR-T细胞疗法在治疗实体瘤方面的效果不如淋巴恶性肿瘤。多种癌症的肿瘤微环境可能会干扰CAR-T细胞的抗癌功能，除了用于CAR构建的肿瘤抗原的特异性。CAR-T细胞与肿瘤细胞之间的细胞间相互作用是这种抗癌方法的关键需求。然而，实体瘤具有丰富的基质，CAR-T细胞必须穿透，这与淋巴恶性肿瘤不同。至少有两种方式，实体瘤微环境限制了CAR-T细胞的有效性。首先，CAR-T细胞的功能可能受到肿瘤介导的免疫抑制的限制。肿瘤微环境通过影响CAR-T细胞的体外操作后的T淋巴细胞功能，从而干扰CAR-T细胞的效力的第二种机制。这可能使它们难以穿透实体瘤的细胞外基质（ECM）。Caruana等人提供了支持上述机制的直接证据。ECM的主要成分，肝素硫酸蛋白聚糖，被酶肝素酶（HPSE）降解，该酶被设计为在CAR-T细胞上表达。HPSE CAR-T细胞减少ECM的能力被证明有助于肿瘤T细胞浸润，并最终提高抗癌效力。然而，由于它们的纳米级大小，CAR-T细胞产生的外泌体可以用作直接的癌症吸引剂，这可能有助于CAR介导的抗癌疗法。从CAR-T细胞产生的外泌体必须能够作为直接攻击者，并且能够针对特定的抗原靶向肿瘤位置，以替代抗癌疗法中的CAR-T细胞。与需要治疗性细胞主动移动到目标部位的基于细胞的疗法不同，无细胞外泌体可以通过生物液体如血液循环传递。外泌体能够穿越生物屏障，包括肿瘤血液屏障（BTB）和血脑屏障（BBB）。这一事实得到了支持，即在体液中发现了源自肿瘤细胞的外泌体。此外，静脉注射的外泌体被肿瘤的高度保留效应和渗漏的血管系统推向肿瘤。据报道，外泌体在体内被动传输，但它们的目标导向分布主要受其表面组织特异性受体的影响，这些受体源自亲代细胞。外泌体可以通过将内容物转移到目标细胞来杀死癌细胞。这可以通过三种不同的机制发生。首先，通过直接接触，外泌体可以与目标细胞表面的特定受体结合，触发促进细胞死亡的信号级联。这种相互作用可以激活诱导凋亡的途径或刺激针对肿瘤细胞的免疫反应。其次，外泌体可以与目标细胞的质膜融合，导致生物活性分子（如蛋白质和核酸）转移到细胞质中。这些转移的组分可以破坏细胞内稳态，启动凋亡途径或干扰关键的细胞过程。最后，外泌体可以通过内吞作用被目标细胞内化，允许其货物释放到细胞内空间。外泌体的内容物，包括蛋白质、脂质和核酸，然后可以发挥细胞毒性作用，触发程序性细胞死亡或调节细胞功能。这三种机制共同展示了外泌体如何有效地介导杀死肿瘤细胞并促进抗癌反应。
4.3.靶向特异性
CAR结构中的抗体衍生的单链可变片段（scFv）控制CAR-T细胞的靶向特异性。靶向攻击属性依赖于CD19特异性scFv在使用CD19-CAR-T细胞治疗CD19阳性血液系统恶性肿瘤的治疗方法中。正常器官或组织中也表达相同的抗原，这就是所谓的“靶向肿瘤外”的影响。细胞膜蛋白，如参与细胞靶向的蛋白，可能在生物发生过程中被运输到外泌体。根据Muntasell等人的研究，在24小时内，B细胞表面结合的肽-MHC II复合物中有12%被内吞、运输到多泡体，并在外泌体上释放。
亲代细胞的外泌体很可能能够传递靶向特性。许多临床前研究支持了这一观点，尽管对CAR-T细胞制造的外泌体还需要更多的研究。Alvarez-Erviti等人在他们的研究中提供了针对性外泌体的直接证据。他们通过基因修饰树突状细胞表达Lamp2b，这是一种与神经元特异性狂犬病病毒糖蛋白（RVG）肽段相关的外泌体膜蛋白，成功制备了针对小鼠大脑的外泌体。然后他们使用这些外泌体作为向大脑输送siRNA的递送系统。RVG的可用性，作为一种配体，精确地与神经元中的乙酰胆碱受体结合，决定了它们在系统递送后如何精确地分布到神经元。由于间充质干细胞（MSCs）对原发和转移肿瘤部位的偏好，MSC介导的抗癌方法成为广泛研究的主题。与细胞对应物相比，CAR-T外泌体提供了几个有希望的优势，包括高靶向特异性、对PD-L1免疫抑制不敏感，以及降低诱发细胞因子释放综合征的风险。来自靶向间皮素（MSLN）的CAR-T细胞的外泌体也观察到了类似的鼓舞人心的结果。这些外泌体通过分泌穿孔素和颗粒酶B，有效地靶向MSLN阳性和三阴性乳腺癌细胞，展示了它们的效率。重要的是，在BT-549和MDA231-MSLN异种移植乳腺癌肿瘤模型中进行的体内研究表明，具有低毒性的显著抗肿瘤效果。这些发现强调了CAR-T外泌体作为一种有前途的癌症治疗方法的潜力。
肿瘤衍生的生物因子和MSCs中匹配受体的存在是MSCs能够进行肿瘤定向归巢的必要条件。肿瘤通常被描述为“永不愈合的伤口”，因为它们是细胞因子、趋化因子和其他炎症介质的持续来源。然而，MSCs表达多种生长因子的受体，如PDGF和IGF-1，以及趋化因子受体，包括CCR2、CCR3、CCR4和CCL5[101]。值得注意的是，所有表面标志物、信号分子和细胞粘附分子也存在于MSC衍生的外泌体中，这表明外泌体可能采用亲代细胞的归巢模式，并获得与其亲代细胞相同的一系列表面受体和相关结合蛋白。
这种天然的趋向性表明，选择理想的细胞来源进行器官特异性治疗方法的外泌体衍生是至关重要的。然而，工程化的CARs可以提供非HLA限制的细胞表面成分识别，并不依赖于HLA进行抗原处理和呈递。因此，CAR-T更广泛地适用于具有多样化HLA的患者群体。
4.4.适应癌症的复杂性和变化
除了赋予CAR-T细胞抗原特异性靶向能力外，工程化的CARs还增强了CAR-T细胞的生长和细胞因子产生。细胞因子是最直接的攻击者，在CAR-T细胞内（主要是白细胞介素，如IL-2、IL-7、IL-15或IL-21）显著扩大。然而，由于癌组织极度异质，癌细胞高度适应，这是药物抗性的基础，没有特定的攻击者或药物能够有效治疗任何特定的癌症。在药物治疗开始之前，几乎所有癌症病例中近50%存在对化疗的内在抗性，而在剩余的50%癌症病例中，获得性抗性发生在相当一部分中。由于癌细胞的巨大异质性和复杂生物学特性，表现出广泛的个体变异，迄今为止所有克服化疗抗性的尝试都失败了。这可能是CD19-CAR-T细胞疗法在CD19+B细胞白血病患者中成功有限的原因。理想的抗癌策略应该是多样化的，并能够同时采取行动，考虑到癌症的异质性和可变性。抗癌药物也可以根据患者的独特情况进行调整。事实上，CAR-T细胞和CAR-T细胞衍生的外泌体提供了执行上述修改的有利平台。
通过CAR-T细胞，可以间接添加额外的抗癌药物。外泌体通过从亲代细胞向受体细胞运输各种信息，包括蛋白质、mRNAs、ncRNAs和miRNAs，作为细胞间通信的手段。外泌体和亲代细胞都含有绝大多数的蛋白质、mRNAs和miRNAs。细胞外蛋白酶和RNases防止外泌体携带的蛋白质和RNAs降解，延长它们的半衰期，并增强它们的生物活性。根据小鼠的临床前研究，从用肿瘤肽脉冲的DCs中分离出的外泌体能够在体内启动特定的细胞毒性T淋巴细胞，并以T细胞依赖的方式抑制已建立的小鼠肿瘤的生长，展示了从亲代细胞到外泌体的刺激诱导信号转移的操纵。以前已经显示，当HepG2（肝癌细胞）和ASPC-1（胰腺癌细胞）暴露于用抗癌基因TRAIL工程化的MSCs的条件培养基（CM）时，它们具有显著的细胞毒性。
由MSCs产生的外泌体可能在将抗癌剂从MSCs运输到癌细胞中起着至关重要的作用。因为TRAIL表达载体被用于这种抗癌基因工程，TRAIL通过外泌体的递送可能以cDNA、mRNA或蛋白质的形式进行。研究表明，使用心肌梗死模型，体外培养的基因修饰MSCs的CM在预防心室重塑方面的效果与细胞移植相当。一个或多个癌细胞攻击者可能在体外扩增的CAR-T细胞中外泌体的生物合成过程中被间接加载。之后，根据患者的治疗情况，可以替换多个和额外的攻击者，当与内在的T淋巴细胞细胞因子结合时。
此外，抗癌药物可以直接装载到由CAR-T细胞制成的外泌体中。外泌体可能包含亲水性和疏水性物质，因为它们类似于脂质体，也具有水核心和双脂膜。对于像mRNA、siRNA和miRNA这样的亲水性分子，可以通过短暂的物理（例如，电穿孔）或化学（例如，脂质体介导）破坏外泌体膜来实现外泌体装载。在Alvarez-Erviti等人的研究中，通过电穿孔将外源siRNA直接装载到树突状细胞衍生的外泌体中，这导致了目标细胞中目标基因的mRNA和蛋白表达显著下调。然而，短暂的直接共孵育可以使外泌体装载疏水性分子。
通过外泌体传递的抗癌基因产物更容易使用，因为它们充当纳米载体。P53、Myc和磷酸酶及张力蛋白同源物（PTEN）是大多数抗癌基因产物影响肿瘤细胞的细胞内机制的例子。在间充质干细胞（MSC）介导的基因治疗领域，MSC被用作传递抗癌基因的载体。细胞内的抗癌基因产物需要在MSC中产生并分泌到细胞外空间，然后它们需要穿透附近的肿瘤细胞，通过生物膜，这是大多数大分子的自然屏障，包括肽和蛋白质。因此，相关表达载体的构建通常包含一个前导序列和一个转录激活因子（TAT）。然而，外泌体已被证明可以穿过血浆膜以将货物传递给受体细胞。例如，来自树突状细胞的外泌体可以将装载有肽段的MHC I和II复合体传递给其他树突状细胞和CD4+T细胞以控制免疫反应。来自亲本细胞的mRNA和蛋白质可以直接转移到受体细胞的细胞质中，避免了生物膜。从理论上讲，通过外泌体生物发生，基因工程化的MSC可以以所有可能的形式传递抗癌基因产物，包括cDNA、mRNA和蛋白质。这可能解释了分泌TRAIL和非分泌TRAIL的工程化MSC诱导的癌细胞死亡之间缺乏区别。显然，外泌体将扩展和改善基于细胞的基因治疗在癌症治疗中的应用，正确应用的话。CAR T细胞衍生的外泌体对肿瘤细胞的一些治疗潜力在表2中总结。
5.结论
利用经过基因改造表达CAR的T淋巴细胞，基于CAR的过继性免疫疗法可以引发既是T细胞介导的，又是针对目标抗原的特异性免疫反应。输注到体内后，CAR-T细胞作为“活药”持续对预期的恶性细胞发起细胞毒性攻击。它们自己的寿命和体内未来的扩展决定了它们强大的肿瘤杀伤能力将持续多久。然而，不可能充分控制CAR-T细胞释放的细胞因子量或这些细胞的体内扩展状态，这是CRS、细胞因子风暴和“靶向肿瘤外”反应等不良事件的潜在来源。
由CAR-T细胞制成的外泌体具有巨大的治疗潜力，因为它们可以取代CAR-T细胞，瞄准肿瘤细胞。外泌体可以作为癌症治疗的直接对手，取代CAR-T细胞，由于它们的无细胞性质和生物学特性，具有明显的优势。首先，使用外泌体作为“现成”试剂使CRS可控。外泌体的适当使用也为CAR-T技术治疗实体瘤铺平了道路，包括由于它们的纳米尺寸而针对特定区域的肿瘤，如胶质母细胞瘤。第三，除了CAR-T细胞的内在细胞因子外，还可以向CAR-T细胞衍生的外泌体中添加额外的攻击者以防止潜在的抗药性，第四，这两种平台（即CAR-T细胞和CAR-T细胞衍生的外泌体）的联合和/或交替使用无疑将加强基于CAR的癌症治疗的应用。
根据图3所示的在临床环境中使用CAR-T细胞衍生的外泌体的提出方法，收集癌症患者的外周血T细胞，将CAR通过病毒或非病毒方式插入T细胞，体外扩展CAR工程化的T细胞，分离外泌体，然后给患者外泌体。基于外泌体的独特特性，如大小（30-150纳米）、密度（1.1-1.18 g/ml）和进化上保守的蛋白质分子集合（CD9、CD63、CD81、Alix和Tsg101），可以从培养基中使用多种技术分离CAR-T细胞衍生的外泌体，包括超滤、超速离心和抗体偶联磁珠上的亲和捕获。
在使用CAR-T细胞衍生的外泌体进行任何临床设置之前，确实有必要进行临床前研究以对它们进行表征。总之，一种有希望的癌症治疗方法是基于CAR的T细胞过继性免疫疗法。作为一种前沿且有效的治疗方法，由于癌症的复杂性和不稳定性，它正遇到一些缺陷或限制。从CAR-T细胞衍生的外泌体可能取代CAR-T细胞，作为终极攻击者，作为这种有效方式的延伸，从而克服当前治疗模型中的一些缺点。通过适当整合细胞和外泌体平台，这种有效的治疗方法将变得更加功能强大，并应使我们更接近于创造一种新的针对性癌症治疗选择。
此外，作为未来发展，我们可以参考选择性地装载所需的mRNA或控制目标基因装载在外泌体中。最近的研究提出了选择性装载mRNA或控制目标基因装载到外泌体中的策略。这包括工程化供体细胞、修改外泌体表面和使用合成纳米颗粒。未来的进展旨在增强特定转录物的靶向和整合，提高稳定性，并优化装载效率。创新的基因递送系统和识别外泌体和受体细胞上的具体标记可以实现精确的货物递送。这些发展为精准医疗和基因治疗等治疗应用带来了希望。
