实验原理：
双荧光素酶报告基因实验通常应用于LncRNA-miRNA；miRNA-mRNA靶向验证验证及启动子转录活性调控等方向研究。
其原理主要是含有萤火虫荧光素酶的基因和海参荧光素酶的基因包含在一个质粒（pmirGLO Vector、Psicheck-2）上，通过质粒构建将我们包含结合位点的目的片段（野生型（WT）、突变型 （Mut））构建在萤火虫荧光素酶的基因或海参荧光素酶的基因的后面，而通过双荧光素酶试剂盒中荧光素和腔肠素分别氧化两种酶并产生生物荧光 ，最后用酶标仪进行检测荧光值。转染miRNA的模拟物或者过表达载体后，与野生型片段结合，降低前者荧光素酶活性，后者即为内参对转染效率以及细胞铺板数量进行标准化。
实验步骤：
接下来以验证miRNA的靶向基因为例，介绍双荧光素酶报告基因实验的步骤：
1、构建荧光素酶报告质粒（WT/Mut）
传统酶切方法：设计引物获取靶基因包含结合位点的目的片段——酶切目的片段和载体——目的片段和载体连接——转化——鉴定——提取质粒
2、293T细胞培养（DMEM+10%FBS+5%双抗）
实验分组设计：
6孔板：Psicheck-2(空质粒载体)
24孔板：对照+处理组（生物学重复3次）
3、质粒转染细胞（一般根据试剂盒的基本步骤进行转染）
（1）细胞铺板
提前一天将细胞种植在六孔板中，以转染时细胞密度在 60%-80%为宜。
（2）转染过程
①在转染前2小时，移除细胞上原有的培养基，换为新鲜的不含抗生素的培养基；
②将2ug质粒 DNA用100μL无血清稀释液（Opti-MEM）稀释，充分混匀后制成 DNA稀释液；
③转染复合物制备：向DNA稀释液中直接加入2μL 转染试剂（参考NeofectTM），轻柔混匀，室温静置 15-30min；
④将转染复合物加入细泡培养基中，轻柔混匀；
⑤继续培养 24-48小时，收取细胞进行鉴定或加入相应抗生素筛选稳定克隆。
提示：推荐各培养体系如下：
注意：转染试剂参考NeofectTM
4、模拟物mimic和对照mimic NC的转染（以ribOFECTTM CP 转染 miRNAmimic 用量参考）
操作方法 ：
5、双报告基因检测（双荧光素酶报告基因试剂盒——酶标仪检测）
（1）试剂配制（根据所购买的试剂盒说明书操作）：一般是稀释、分装试剂，避免反复冻融。
（2）样品（细胞）处理：动物细胞：
①贴壁细胞：去除细胞培养基，用1×PBS润洗1-2次，加入1×Cell Lysis Buffer，室温充分裂解10min，并刮取细胞于1.5 ml离心管中；
②悬浮细胞：收集细胞，300× g离心5分钟，去除原有培养基；
③加入1xCell Lysis Bufer，吹打混匀，室温充分裂解10min。
注意：1xCell Lysis Bufer加入量参考：
（3）裂解完成后，4℃，12,000×g离心10min，取上清待检测。
（4）荧光检测（试剂盒使用前需要提前恢复至室温）：
将30 ul平衡至室温的试剂Ⅰ（检测萤火虫荧光素酶）加入1.5 ml离心管或者不透明96孔板中，再小心吸取20 ul裂解物至反应管或板中，水平震荡混匀，于化学发光仪(luminometer)中检测萤火虫荧光素酶报告基因的活性。之后吸取30ul平衡至室温的试剂Ⅱ（检测海肾荧光素酶）加入上述反应管或板中，水平震荡混匀，于化学发光仪中检测海肾荧光素酶报告基因的活性。
本文作者是"旺旺仙贝"同学，在获得授权后，实验老司机将本文发表于公众号。
文稿：旺旺仙贝
校对：煲仔饭
素材：
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