亲爱的小伙伴们，注意啦！乳腺癌这位“健康大敌”现在越来越年轻化。因此，咱们得行动起来，保持良好的生活习惯，锻炼身体。记得常体检，早发现早治疗。现在，来瞅瞅对付乳腺癌的新招儿吧！！下面这篇文章从表观遗传入手，涉及多种修饰，思路非常值得借鉴！快来跟着小仙一起学习吧~
1.多层次和方法进行验证：研究构建体外小鼠乳腺癌放射模型和对体外癌细胞进行辐射，使用LC-MS/MS分析、免疫沉淀和MS（IP/MS）、细胞活力测定、克隆形成细胞存活分析、异种移植肿瘤、免疫荧光、RNA分离和qRT-PCR和RNA测序富集分析等方法揭示DTL泛素化RUVBL1促进RUVBL1/2-β-catenin介导的NHEJ通路转录调控并并增强乳腺癌的放射抗性。
2.潜在的临床应用前景：本文首次揭示DTL-RUVBL1/2β-catenin在乳腺癌放射抗性中的作用机制的研究。DTL泛素化RUVBL1促进RUVBL1/2-β-catenin复合物的形成，从而调控NHEJ修复通路分子的转录，增强乳腺癌细胞对放射治疗的抵抗力。这为乳腺癌放射抗性的治疗提供新的思路。
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题目：DTL泛素化RUVBL1促进RUVBL1/2-β-catenin介导的NHEJ通路转录调控并增强乳腺癌的放射抗性
杂志：Cell Death Dis
影响因子：IF=8.1
发表时间：2024年4月
研究背景
乳腺癌是女性中最常见的癌症类型，也是全球女性癌症相关死亡的第二大原因。放射治疗仍然是乳腺癌手术后的主要治疗方法，不仅可以改善原发癌的生长，还可以降低复发和远处转移的风险。然而，很大一部分乳腺癌患者在放疗后10年内继续复发，并且患者对放疗产生抵抗，导致总体生存率低。然而，放射抗性的机制尚未完全了解。
研究思路
研究结果
1.RUVBL1在乳腺癌放射治疗中担当着重要角色
研究利用MMTV-PyMT小鼠构建乳腺癌放射治疗模型。当小鼠乳腺癌肿瘤长到一定大小（200 mm3）时，治疗组给予连续5个间隔的放射治疗（3 Gy）（图1A）。正如预期的那样，与对照组相比，受照射肿瘤的生长得到了显着控制（图1B，C）。为了探究乳腺癌放射治疗后蛋白质组学的差异，研究收集了小鼠乳腺癌组织进行质谱分析，经质谱分析后共鉴定出2130个蛋白质，其中148个蛋白质在放射治疗组中显著增加，而200个蛋白质在放射治疗组中显著减少（图1D，E）。对这些差异表达蛋白进行进一步的功能富集分析表明，这些蛋白主要参与蛋白质转移、细胞间粘附、DNA修复、碳水化合物代谢以及泛素化依赖的蛋白质降解等生物过程（图1F）。在与DNA修复相关的差异蛋白中，发现RUVBL1在接受放射治疗的不同肿瘤组织中始终保持高表达水平（图1G）。后续在接受放射治疗和未接受放射治疗的小鼠乳腺肿瘤组织中的研究也证实，RUVBL1在接受放射治疗的组中高表达（图1H，I）。这些结果表明放射治疗诱导了RUVBL1的表达，也提示RUVBL1可能在乳腺癌放射抗性中起调控作用。
图1：RUVBL1在放射乳腺肿瘤组织中的表达相对较高
2.RUVBL1高表达增强乳腺癌的放射耐受性
研究构建了在乳腺癌细胞中稳定过表达或敲除RUVBL1的细胞系（图2A、B）。随后对这些细胞系进行不同剂量的照射，结果表明RUVBL1的过表达显着增加了细胞活力和繁殖（图2C、E、G）。相反，敲除RUVBL1显着降低了细胞活力和繁殖（图2D、F、H）。此外，还检测了放射治疗后过表达RUVBL1的乳腺癌细胞的DNA损伤水平，结果表明过表达RUVBL1显着降低了乳腺癌细胞中γ-H2 AX蛋白的表达水平（图2I、J）。结果表明，RUVBL1的过表达显着增加了肿瘤生长和重量（图2L、M）。这些结果表明RUVBL1调节乳腺癌细胞对放射治疗的抵抗。
图2：RUVBL1调节乳腺癌细胞的辐射抗性
3.DTL通过泛素K63泛素化RUVBL1
研究使用CoIP和质谱法来寻找RUVBL1可能结合的蛋白质（图3A）。质谱和免疫共沉淀证实RUVBL1可以与DTL结合（图3B、C）。因此，检测了RUVBL1的泛素化水平，结果显示，在HEK293T细胞中，DTL-泛素化RUVBL1（图3D），在乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞中也得到了验证（图3E，F）。随后的蛋白半衰期结果表明，DTL的过表达并不影响RUVBL1蛋白的稳定性（图3G）。进一步的泛素化实验结果表明，DTL对RUVBL1的泛素化修饰为Ub K63模式（图3H）。在MDA-MB-231-RR细胞中检测了DTL对辐射后RUVBL1泛素化的影响，发现DTL促进RUVBL1泛素化（图3I）。在MDAMB-231-RR细胞中也进行了免疫沉淀实验，观察到当仅存在K63位点时，这些蛋白质之间存在稳健的结合（图3J）。上述结果表明DTL通过泛素化RUVBL1的K63位点在乳腺癌细胞的辐射耐受中起关键作用。
图3：RUVBL1增强DNA损伤修复，并被DTL泛素化
4.RUVBL1以DTL依赖性方式调节乳腺癌辐射抗性
研究构建了过表达或敲低DTL的乳腺癌细胞系（图4A、B）。在不同的辐射剂量下，DTL的过表达显着增加了细胞活力和繁殖（图4C、E、G）。相比之下，DTL的敲减显着降低了细胞活力和繁殖（图4D、F、H）。最后，将过表达DTL的乳腺癌细胞接种到裸小鼠中，并在肿瘤生长12天后连续照射（图4J）。结果表明，DTL的过表达显着增加了肿瘤生长和重量（图4I-K）。这些结果表明DTL具有调节乳腺癌辐射抵抗的功能，与RUVBL1的功能相似。
图4：DTL调节乳腺癌细胞的放射抗性
为了进一步了解RUVBL1和DTL在乳腺癌放射抗性调控中的作用，在RUVBL1过表达的MDA-MB-231细胞中敲低DTL，以分析乳腺癌对放射治疗的抗性（图5A）。随后，用不同剂量的辐射照射这些细胞，敲低DTL明显逆转了RUVBL1增强乳腺癌细胞放射抗性的作用（图5B-D）。RUVBL1过表达和DTL敲低细胞体内成瘤后再进行放射治疗也显示出类似的结果（图5E-G）。通过研究了DTL敲低后MDA-MB-231-RR细胞系的放射抗性变化（图5H），发现MDA-MB-231-RR细胞的放射敏感性增加（图5I、J）。此外，发现DTL敲低后RUVBL1泛素化水平降低（图5K）。这些结果表明DTL-RUVBL1在MDA-MB-231-RR辐射耐受性中发挥重要作用。
图5：RUVBL1通过DTL调控乳腺癌细胞的放射抗性
5.DTL泛素化RUVBL1以减弱H4K16乙酰化
研究表明过表达RUVBL1可以显著促进H4K16ac水平的提高，但是过表达DTL却显著降低了RUVBL1对H4K16的乙酰化修饰（图6A）。一致的是，DTL敲除显著促进了RUVBL1对H4K16的乙酰化修饰（图6B）。随后发现DTL显著促进了RUVBL1与RUVBL2的相互作用，而抑制了RUVBL1与TIP60的相互作用（图6C、D）。进一步的实验还证实了DTL对RUVBL1的K63泛素化修饰促进了RUVBL1与RUVBL2的相互作用（图6E、F）。在MDA-MB-231-RR细胞中，当DTL水平低时，RUVBL1与RUVBL2的结合减少。然而，RUVBL1和TIP60的结合增加（图6G）。这些结果表明DTL-RUVBL1不通过TIP60-H4K16ac促进HR途径。
图6：DTL-泛素化-RUVBL1减弱H4K16乙酰化介导的HR修复途径
6.DTL泛素化RUVBL1促进了RUVBL1/2-β-catenin复合物的形成
研究对稳定过表达RUVBL1的放射辐照乳腺癌细胞进行了转录组分析（RNA-seq）。与对照细胞相比，发现ruvbl1高表达细胞中547个基因的表达发生显著变化（图7A、B）。差异表达基因功能富集分析显示，β-catenin复合物组装、双链断裂非同源末端修复（NHEJ）和Jak-STAT信号通路富集，这些信号通路与细胞辐射抗性相关（图7C、D）。进一步的免疫共沉淀结果显示，RUVBL1能分别与β-catenin、c-Myc和STAT3相互作用（图7E）。然而，过表达DTL仅显著增加RUVBL1与β-catenin的相互作用（图7E）。后续的泛素化实验进一步验证，通过DTL的K63泛素化修饰的RUVBL1增加了与β-catenin的相互作用（图7F）。这在MDAMB-231-RR细胞中也得到了验证，当Ub-K63存在时，RUVBL1与RUVBL2和β-catenin均能强结合（图7G）。这些结果表明DTL-泛素化-RUVBL1促进RUVBL1与β-catenin的相互作用。
图7：DTL促进RUVBL1与转录辅因子β-catenin的结合
7.DTL泛素化RUVBL1通过β-catenin介导的转录调控促进NHEJ修复分子的表达
研究发现，在乳腺癌细胞中，RUVBL1/DTL的过表达显著增加了NHEJ修复途径分子K70、K80、DNA-PKcs、53BP1、LIG4和XRCC4的表达（图8A、B）。报告基因的结果也表明NHEJ修复通路的激活是由RUVBL1启动的(图8C)。DTL敲低显著逆转了RUVBL1增加的NHEJ修复分子表达（图8D-F）。
图8：RUVBL1影响NHEJ通路基因的表达，并受DTL的调控
敲低β-catenin显著降低了体外和体内RUVBL1-DTL介导的乳腺癌的放射抗性（图9A-G）。这些结果表明DTL-泛素化-RUVBL1通过β-catenin转录调节NHEJ修复分子的表达，从而增强乳腺癌细胞的放射抗性（图9H）。
图9：DTL-RUVBL1-β-catenin调节乳腺癌细胞的放射抗性
文章小结
本研究揭示DTL泛素化RUVBL1促进RUVBL1/2-β-catenin复合物的形成，从而调控NHEJ修复通路分子的转录，增强乳腺癌细胞对放射治疗的抗性。本篇文章将转录调控研究到了极致，有许多表观修饰，比如泛素化和乙酰化。这些表观修饰完全可以运用到其他癌症中，如果你对此感兴趣，快扫码联系小仙吧~
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