1上海理工大学健康科学与工程学院，上海
2上海交通大学医学院附属新华医院普通外科 上海市胆道疾病研究中心 上海市胆道疾病研究重点实验室，上海
3上海交通大学医学院附属仁济医院胆胰外科 上海市肿瘤研究所 肿瘤系统医学全国重点实验室，上海
消化系统肿瘤；肿瘤内微生物；肿瘤内细菌；抗肿瘤治疗；预后
全世界癌症统计数据显示：癌症已成为≤70岁人群的主要死亡原因［1］。尽管对癌症的研究不断深入，但其发病机制仍未完全清楚，且缺乏有效的治疗方法和药物靶点。肿瘤内微生物群在影响癌症的发生、转移、临床病理特征和治疗反应等方面发挥重要作用［2‑3］。人体微生物群由数万亿个微生物组成，主要包括细菌、真菌和病毒，其中以细菌为主［2，4‑5］。人体内的细菌广泛分布于各个组织和器官，包括皮肤、呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统。已有研究结果证实肠道菌群在维持生理平衡和疾病发展中起关键作用［3］。最近多项研究结果显示：部分传统上被认为是无菌的器官，如甲状腺、胰腺和肝脏等，也存在细菌等微生物［6‑8］。Nejman等［9］对7种癌症类型的1526个肿瘤和相邻组织的微生物组成进行综合分析，首次揭示不同癌症类型的特定微生物组成，并确认肿瘤内细菌主要存在于细胞内，包括癌细胞和免疫细胞。
鉴于目前对肿瘤细胞内细菌的研究有限，且难以准确区分肿瘤内和细胞内的差异，笔者将“肿瘤内菌群”定义为与肿瘤相关的菌群，包括存在于肿瘤细胞内或肿瘤微环境内的细菌。本文主要概述肿瘤内菌群的最新研究进展，重点关注消化系统肿瘤内细菌的组成和功能，并探讨其潜在的临床应用，旨在为相关研究提供参考。
一、肿瘤与细菌
研究人员运用多种实验技术手段，包括荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）、PCR和16S rRNA测序，证实肿瘤内细菌的存在［9‑11］。然而，这些细菌的具体来源仍未明确。基于现有研究，肿瘤内细菌的潜在来源有以下途径：（1）肿瘤内细菌可能来自邻近的正常组织。人体的多个黏膜器官，如肺、胃肠道和皮肤，都含有大量微生物［12］。肿瘤通过改变黏膜屏障的原始解剖结构，破坏其完整性，导致局部免疫抑制和炎症反应，进而有利于微生物的入侵［13］。这种假说也为肿瘤组织与相邻正常组织微生物之间存在相似性提供合理解释［14］。（2）口腔‑肠道细菌易位可能导致细菌在非口腔肿瘤组织中富集。例如，牙周病与增加的癌症风险相关联，尤其是胰腺癌，同时也包括肺癌、头颈癌、食管癌、乳腺癌以及结直肠癌等［15‑16］。特定的牙周细菌如具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌具有侵入和定植的能力［17‑18］。在胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）中，肠道细菌可利用解剖结构直接从胃肠道迁移至肿瘤组织中［6］。来自慢性肝炎患者的肠道菌群可促进小鼠肝肿瘤的形成［19］。细菌进入肿瘤微环境后，该部位的独特环境如营养丰富、低pH值、坏死区域以及缺氧状况等，为其定植和生存提供了有利条件［20‑21］。（3）瘤内菌群可能通过循环系统扩散，这解释了转移灶中细菌定植的可能机制。例如，在鼠乳腺癌模型中，循环肿瘤细胞和肺部的转移灶中均检测到相似菌群，这提示一些细菌，特别是细胞内细菌，可能通过血液循环迁移并定植于远处的转移部位［22］。此外，肠道细菌也可能通过RBC或免疫细胞传播至身体其他部位［23］。在通常被认为无菌的脑肿瘤和骨肿瘤中检测到细菌DNA，这提示细菌可能通过血液循环进入肿瘤微环境［9］。尽管研究者已提出多种假说，但细菌在肿瘤组织中聚集的具体机制仍需进一步研究阐明。
微生物组如何影响肿瘤的发生和发展一直是癌症研究领域的热点。目前，肿瘤内菌群影响肿瘤进展的机制可总结为以下几种：（1）瘤内菌群直接影响宿主基因组，促进肿瘤发生。细菌产生的毒素及其代谢产物可直接作用于细胞DNA，诱发基因突变，进而促进肿瘤形成。例如，携带多酮合成酶的大肠埃希菌能诱导DNA双链断裂，干扰细胞周期［24］。铜绿假单胞菌分泌的毒素能导致DNA损伤和活性氧水平升高，进而增加对DNA碱基的敏感性，使得在脂质过氧化过程中发生DNA键断裂和染色质交联［25‑26］。此外，牙龈卟啉单胞菌表达的肽基精氨酸脱氨酶能增加TP53和KRAS的突变率，促进PDAC的发生［27‑28］。（2）瘤内菌群可改变肿瘤微环境，影响肿瘤进展。越来越多的研究证据显示：肿瘤内微生物群在重塑肿瘤微环境中扮演关键角色。Ochi等［29］的研究结果显示：脂多糖通过激活Toll样受体4通路维持与炎症相关基因的表达，引发持续炎症反应。这种炎症反应进一步促进树突状细胞、巨噬细胞和淋巴细胞的活化，加剧胰腺纤维炎和胰腺导管内上皮瘤变，加速PDAC的进展。此外，肿瘤内细菌还能促进免疫细胞的招募和激活，例如具核梭杆菌可特异性招募髓系细胞和肿瘤相关巨噬细胞，形成免疫抑制微环境［30‑31］。Pushalkar等［32］的研究结果显示：PDAC中的特定菌群通过激活Toll样受体和调节免疫细胞功能，影响肿瘤耐受性免疫反应。（3）瘤内菌群通过多种途径促进肿瘤转移。肿瘤转移是癌症相关死亡的主要原因之一，而肿瘤细胞主要通过淋巴系统或血液系统在全身传播［33］。结直肠癌中的特定菌群能破坏肠道血管屏障，导致细菌转移至远端组织。进一步通过招募先天免疫细胞（巨噬细胞和中性粒细胞），促进肿瘤细胞在转移部位的播种和定植［34］。Fu等［22］的研究结果显示：肿瘤内细菌通过重塑肌动蛋白细胞骨架增强循环肿瘤细胞抵抗流体剪切应力，帮助肿瘤细胞存活并使其安全到达转移部位。此外，某些特定细菌还能介导肿瘤细胞优先转移至特定部位。例如，在非小细胞肺癌患者中，褪色沙雷氏菌感染患者容易发生脑转移，而阴沟肠杆菌感染患者则容易发生纵隔淋巴结转移［35］。因此，肿瘤内菌群在肿瘤进展的各个阶段都起着关键作用，干预特定的菌群对提高临床疗效具有重要意义。
二、消化系统肿瘤中的菌群特征
原发性肝癌是全世界常见的癌症类型之一［36］。其中肝细胞癌在所有原发性肝癌的占比>80%［1］。近期研究结果显示：肠道和口腔微生物群在肝细胞癌的发病、诊断和治疗中起着关键作用［37‑39］。Huang等［40］的研究首次证实肝细胞癌组织中存在活菌。肝细胞癌组织中的主导菌群是γ‑变形菌纲，而链球菌科和乳球菌属是肝硬化的标志性菌群。在HBV阴性的肝细胞癌患者中，葡萄球菌属和柄杆菌属选择性富集。高丰度的变形菌门和厚壁菌门与肝细胞癌患者的临床病理特征有关，提示这些细菌可能与肝细胞癌的发展密切相关。同时运用FISH实验检测微生物DNA，结果表明RBC可能在细菌进入肝脏的过程中发挥关键作用。另有研究针对细菌16S rRNA测序，结果显示：正常肝脏中的细菌多样性低于肝癌组织，且两者细菌组成存在明显差异。其中变形菌门、厚壁菌门和放线菌门在肿瘤周围和肝癌组织中持续富集［41］。还有研究结果显示：多发性病变肝细胞癌患者的微生物组呈现异质性，阿克曼氏菌属和甲基杆菌属的高丰度与较好的总生存时间和无复发生存时间相关［42］。
胃癌是全世界第五大常见恶性肿瘤［1］。幽门螺杆菌持续感染是胃癌发生的高危因素之一［43］。其通过多种机制引发DNA突变，包括双链DNA断裂破坏、错配修复基因减少、DNA甲基化异常以及诱导胞苷脱氨酶表达增加［44］。CagA、VacA和OipA蛋白是幽门螺杆菌的关键致癌因子。CagA蛋白通过T4SS系统与α5β1整合素结合，激活磷酸化依赖性和非依赖性通路，影响癌基因和信号蛋白，进而促进胃癌进展［45‑47］。传统认为胃内高酸性环境能消除大多数细菌，但近期研究结果显示：除幽门螺杆菌外，胃内还存在多种细菌［48］。与正常组织比较，胃癌组织的微生物多样性显著降低，主要由螺杆菌属、乳杆菌属、链球菌属、普雷沃氏菌属和拟杆菌属组成。与其他胃癌亚型比较，微卫星不稳定性高的胃癌中菌群的多样性更为丰富［49］。此外，胃腺癌中克雷伯氏菌属的丰度与患者的整体生存呈正相关［50］。同时幽门螺杆菌感染状态也会影响微生物组成。幽门螺杆菌水平较低的胃癌患者显示出更加丰富的微生物多样性［49］。Maldonado‑Contreras等［51］分析幽门螺杆菌阳性患者的胃微生物组，结果显示：幽门螺杆菌感染导致放线菌属、拟杆菌门和厚壁菌门的丰度降低，而变形菌门和酸杆菌门丰度增加，显著改变胃组织中的细菌组成。此外，1项观察性研究结果显示：成功根除幽门螺杆菌可以逆转胃组织菌群失调并产生有益影响［52］。
结直肠癌作为全世界第三大常见恶性肿瘤，在我国其发病率正迅速攀升［53］。鉴于肠道是人体内微生物的主要栖息地，肠道菌群在肠道生理与病理过程中的核心作用已成为当前研究焦点［54⁃55］。与其他国家比较，中国结直肠癌患者的肠道细菌组成呈现独特特征：厚壁菌门比例较低，而疣微菌门比例较高［56］。几项关于我国不同民族结直肠癌患者的肠道宏基因组研究结果显示：特定菌属如梭杆菌属、小单胞菌属、消化链球菌属、孪生球菌属、普雷沃氏菌属及细小杆菌属在结直肠癌组织中显著富集［57‑59］。Wong和Yu［60］的研究结果显示：具核梭杆菌、产肠毒素脆弱类杆菌、pks+大肠杆菌及微小微单胞菌等“致癌菌”在结直肠癌的发生和发展中发挥重要作用。肠道菌群的致癌机制涉及多个方面，包括菌群失衡、致病性微生物的侵袭与定植，以及微生物代谢物和毒力因子对肠道屏障的破坏等［61⁃62］。例如，产肠毒素脆弱类杆菌能够释放肠毒素，破坏肠上皮的通透性，进而激活多个肿瘤驱动信号通路，持续刺激Th17免疫应答，促进结直肠癌的进展［60］。而具核梭杆菌则通过分泌特有的FadA粘附素与E‑钙黏蛋白结合，形成特定复合物，进一步激活Wnt/β‑catenin信号通路，促进结直肠癌的发生和发展［63‑64］。尽管肠道菌群与结直肠癌相关性的研究已取得显著成果，但仍需进行更高质量的体内外验证和深入分析，以全面揭示结直肠癌变的具体分子机制。
胰腺癌是一种致死率极高的恶性肿瘤［1］。据预测，到2025年胰腺癌将超过乳腺癌成为癌症死亡的第三大原因［65］。PDAC是最常见的胰腺癌类型，占总病例的85%以上。由于胰液的碱性环境和消化酶的存在，传统观念认为胰腺是无菌器官［66］。Geller等［67］首次在人胰腺癌组织中鉴定出细菌，研究者对113例患者的胰腺癌组织和20份器官供者的正常胰腺组织进行16S rRNA检测。结果显示：仅有15%的正常胰腺样本中存在细菌，而在胰腺癌样本中的检出率高达76%。对其中65例进行深度测序，发现最常见的菌群是γ‑变形菌纲，其主要成员包括肠杆菌科和假单胞菌科。考虑到胰管与十二指肠相通，且十二指肠中主要存在的细菌种类为变形菌门，提示逆行迁移可能是PDAC相关细菌的来源之一。此外，Riquelme等［6］的研究结果显示：PDAC长期生存患者的肿瘤微生物组表现出更高的α多样性，并确定假黄单胞菌属、链霉菌属、糖多孢菌属和克劳氏芽孢杆菌组合能够高度预测患者长期生存。通过动物模型，进一步发现肿瘤内菌群与肠道菌群的相互作用会影响PDAC宿主免疫反应和疾病状态。随后，Pushalkar等［32］在胰腺癌基因工程小鼠模型中使用FISH和实时定量PCR技术，也发现肿瘤中丰富的细菌群落。PDAC是一种炎症驱动型癌症，其显著特征是纤维炎症微环境［68］。Guo等［69］的研究结果显示：胰腺癌基底样亚型中存在独特的微生物群落。其中不动杆菌属、假单胞菌属和鞘氨醇盒菌属这3类细菌的丰度与肿瘤发生密切相关。通过进一步分析宿主‑微生物群相互作用，肿瘤微生物组与PDAC发生和炎症诱导之间存在紧密联系。另1项研究证明胰腺癌中的肿瘤内细菌主要存在于肿瘤和免疫细胞的细胞质中，这与主要存在于肠道的肠道菌群不同［9］。随着技术的进步和研究的深入，有望逐步揭示肿瘤内菌群和肠道菌群之间的更多差异。
胆道肿瘤是发生在胆道系统不同位置的具有高度异质性的恶性肿瘤，主要包括肝内胆管癌、肝外胆管癌和胆囊癌［70］。流行病学研究表明多种危险因素与其发生密切相关，包括胆管囊肿、原发性硬化性胆管炎和胆石症等［71⁃72］。最近，越来越多的研究关注微生物环境对胆道肿瘤的影响，尤其是胆道的特殊结构和功能，使胆道肿瘤的微环境更复杂［73］。
Chng等［74］对肝吸虫感染或未感染的胆管癌组织进行16S rRNA测序分析，结果显示：感染胆管组织中存在独特的微生物组。与正常组织比较，癌组织中寡养单胞菌属水平明显增加。此外，肝吸虫感染的胆管癌中存在特定肠道细菌，分别是双歧杆菌科、肠杆菌科和肠球菌科，提示细菌、寄生虫和胆管癌之间存在关联机制。Chai等［75］使用染色、FISH和透射电镜等方法确认了肝内胆管癌组织中存在微生物DNA，并在肝内胆管癌新鲜组织中成功培养出革兰需氧菌，鉴定为头葡萄球菌。其进一步通过16S rRNA测序确定肝内胆管癌组织中的细菌宏基因组特征。该研究结果显示：癌组织中最丰富的菌群为伯克霍尔德氏菌目、假单胞菌目、黄单胞菌目和芽孢杆菌目，单细胞测序阐明肿瘤内细菌可能存在于多种细胞类型中［75］。
Aviles‑Jimenez团队对100例肝外胆管癌患者和100例良性胆道疾病患者的胆管上皮细胞样本进行测序分析，探索肝外胆管癌中特定微生物的存在模式。在肿瘤患者中，涅斯捷连科氏菌属的丰度降低，而嗜甲基菌科和梭杆菌属的丰度则升高［76］。此外，Miyabe等［77］分析胆管癌患者的胆汁微生物特征，结果显示：微生物群驱动的炎症可能在肝门部周围胆管癌的发病和进展中起重要作用。
胆囊癌是一种常见的胆道恶性肿瘤，通常预后不佳，其发展与长期慢性炎症密切相关［78］。细菌感染显著增加了患胆囊癌的风险。Tsuchiya等［79］对胆囊癌和胆石症患者的胆汁样本进行比较分析，结果显示：胆囊癌患者中细菌感染的发生率显著高于胆石症患者。在胆囊癌患者的胆汁中，优势菌种包括具核梭杆菌、大肠埃希菌和肠细菌属［79］。笔者团队采用宏基因组测序技术深入分析慢性结石性胆囊炎与胆囊癌患者胆汁微生物组成的变化，研究结果显示：两种疾病在微生物组成和基因功能上的显著差异，其中胃消化链球菌和屎肠球菌可能在胆囊癌的进展中发挥作用［52］。此外，特定微生物的相对丰度与胆囊癌患者的总体生存预后之间也存在显著关联［80］。因此，通过抗炎治疗和改善卫生习惯来针对细菌感染可能会降低胆囊癌的发病率。
三、肿瘤内菌群的临床应用潜力
鉴于肿瘤组织与健康组织在细菌丰度和组成上的显著差异，肿瘤内菌群展现出作为创新诊断和预后标志物的巨大潜力［69，81］。目前，研究人员正利用这一发现开发诊断模型，以辅助各类肿瘤的临床诊断。Huang等［40］利用瘤内细菌的特征构建一个用于肝细胞癌预测的机器学习模型，表明特定的分类单元可以作为诊断和治疗干预的潜在目标。Merali等［82］对31例接受ERCP或经皮肝穿刺胆管造影检查患者的胆汁样本进行16S rRNA序列分析，结果显示：PDAC患者与良性疾病患者之间的胆汁微生物的β多样性存在显著差异。PDAC样本中3个细菌属的丰度明显低于良性患者样本组，表明这种基于胆汁的微生物群可以作为PDAC的潜在诊断和预后标志物［82］。此外，微生物组学还能区分不同肿瘤分期。Dai等［83］的研究结果显示：根据鞘氨醇单胞菌属的丰度可以区分甲状腺癌N0期和N1期患者，且其高丰度与淋巴结转移相关。
肿瘤内菌群不仅可用于预测预后，还可用于评估治疗反应。例如，Sun等［84］将接受新辅助放化疗的晚期直肠癌患者分为病理学完全缓解组和非病理学完全缓解组，进一步对这两组微生物特征进行多组学分析。研究者在病理学完全缓解组和非病理学完全缓解组之间发现12种差异菌群，其中7种差异菌群相对丰度的风险评分对新辅助放化疗反应具有预测价值。同样，该团队对肿瘤微环境中的微生物群进行谱系聚类后将肝细胞癌患者分为两种肝型肝细胞癌，并指出该分类可作为肝细胞癌切除患者的独立预后因素［42］。
微生物组学在作为癌症诊断和预后工具方面展示了巨大的潜力。未来，结合液体活组织检查、肿瘤标志物和细胞成像等技术，有望极大提高对肿瘤发展和患者预后的准确预测。
传统化疗仍然是治疗各类癌症的主流方式。然而，肿瘤内细菌的存在可能成为化疗药物耐药的一个潜在原因。Geller等［67］的研究揭示了肿瘤内细菌在介导吉西他滨耐药方面的重要作用，结果显示：在PDAC中，γ‑变形菌纲是优势菌群，该类细菌表达的一种胞苷脱氨酶能够将吉西他滨代谢成无活性的二氟脱氧尿苷。通过在治疗方案中添加抗菌药物环丙沙星，可以消除对这一过程的抗性。因此，肿瘤内细菌的存在可能导致肿瘤内的实际药物浓度低于其他器官［67］。具核梭杆菌是结直肠癌组织中的主要细菌，与癌症进展和不良预后有关［85］。在1项针对具核梭杆菌的小分子抑制剂的筛选研究中，15%的抑制剂属于抗肿瘤药物，包括5‑氟尿嘧啶。在结直肠癌肿瘤内，5‑氟尿嘧啶会破坏菌群平衡，导致5‑氟尿嘧啶的消耗增加，进而降低药物的局部疗效［86］。了解肿瘤内菌群对治疗效果和不良反应的影响，有助于根据患者的菌群特征个性化制订治疗方案，优化剂量，并尽量减少不良反应。
近年来，免疫治疗已成为一种新兴的治疗手段［87⁃91］。免疫检查点抑制剂作为一种特定形式的免疫疗法，靶向与免疫逃逸有关的免疫检查点途径。目前，PD‑1、PD‑L1和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4的免疫检查点抑制剂已用于各类肿瘤治疗［92⁃95］。在肿瘤微环境中，肿瘤内微生物可能对免疫细胞的作用和效应产生影响［96］。有研究结果显示：PDAC相关的细菌能够激活单核细胞中的特定Toll样受体，引发免疫耐受反应［97］。此外，肠道细菌消融可诱导肿瘤微环境的免疫重编程，显著增加效应T细胞上PD‑1的表达，为抗菌药物与免疫检查点抑制剂联合应用提供理论基础［32］。Vétizou等［98］的研究结果显示：脆弱拟杆菌能够通过其脂多糖成分激活肠道局部的先天性免疫应答，进而增强细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4抗体的治疗效果。另有研究结果显示：在黑色素瘤患者体内，罗伊氏乳杆菌能够迁移到肿瘤微环境中，并通过代谢产生吲哚‑3‑醛，刺激肿瘤局部CD8细胞产生干扰素‑γ，从而增强PD‑1抗体的疗效［99］。此外，Jiang等［100］的研究结果显示：在转移性结直肠癌患者体内富集的具核梭杆菌产生的琥珀酸可通过环状磷酸鸟苷⁃磷酸腺苷合成酶‑干扰素β信号通路，降低肿瘤中Th1型趋化因子CCL5和CXCL10的水平，进而限制CD8+ T细胞向肿瘤微环境的浸润。目前，有关瘤内细菌对抗肿瘤免疫治疗影响的研究仍处于实验阶段。未来需要进一步明确微生物在肿瘤治疗中的作用机制，以推进现有治疗策略的优化。
利用现代生物工程技术改造天然细菌，使其成为工程菌，具有优先靶向肿瘤、侵袭性渗透组织、易识别和低毒等特点。工程菌在癌症治疗中的主要作用包括以下几点：直接诱导癌细胞凋亡或自噬；作为药物输送系统，将药物准确输送到肿瘤病灶并在原位合成特定治疗药物以及诱导抗肿瘤免疫反应［101‑102］。例如，联合应用表达两种趋化因子hCXCL16K42A和CCL20的基因工程菌，能够有效招募参与肿瘤免疫反应启动和反应阶段的先天性免疫细胞和适应性免疫细胞，进一步增强整体抗肿瘤免疫反应，从而显著提升治疗效果［103］。Vincent等［104］开发新型的益生菌介导嵌合抗原受体T细胞平台，用于治疗实体瘤。该方法利用益生菌靶向肿瘤定植并释放合成靶标以标记肿瘤组织，从而实现嵌合抗原受体介导的原位裂解，进一步提升嵌合抗原受体T细胞在治疗实体瘤时的安全性和高效性。这种创新方法为实体瘤的嵌合抗原受体T细胞免疫治疗提供了一种前瞻性的治疗策略。然而，这些细菌应用于临床仍面临诸多挑战，包括安全性问题、如何平衡细菌的毒力和抗肿瘤能力，以及解决遗传不稳定性等［96］。随着合成生物学的发展，细菌介导的癌症治疗或将成为未来癌症治疗的创新方式。
四、小结
虽然肿瘤内菌群的研究已取得一定进展，但该领域仍处于探索阶段。由于肿瘤内微生物的生物载量较低，这类研究面临着技术和生物学上的诸多挑战，如环境污染、样本批次的影响、测序分析能力的限制，以及细胞内定位的准确度问题等。为了克服这些干扰，未来的实验需要设计更加稳健和多样化的控制及分析方法。此外，由于细菌物种和亚种之间存在差异，以及在低生物量微环境中的限制，通常只将细菌按属分组，忽视了特定菌株的多样性和独立作用。同一细菌在不同样本间，甚至在同一样本内也可能呈现出异质性。因此，发展动物模型或类器官模型来研究细菌的侵入过程，将进一步帮助广大医师理解特定菌群的定植程度和潜在功能。综上，肿瘤内菌群研究具有巨大的临床转化潜力，有望成为抗肿瘤治疗领域的新焦点。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
