在天然产物、香精香料、食品风味分析、环境及车内空气分析等领域中，GC/MS是定性分析其中挥发性物质的最常用、且最方便手段。在NIST、Wiley等数据库的帮助下，我们可以轻松对GC/MS采集的未知物谱图进行搜库，以确定可能的疑似物，然后再通过标准品对照来最终定性。但如果质谱谱库或数据库本身没有收录的化合物，那要怎么来定性确定呢？
本期的内容将介绍在GC/MS上利用MassWorks软件对未知化合物的分子离子和相关碎片离子的精确质量数进行测定，并对其进行定性鉴别。
在MS分析中涉及的碎片离子，多年来积累了丰富的知识，McLafferty在权威论文中系统地总结了这些知识。在GC/MS分析中遇到的典型的EI碎片离子，如表1所示。NIST谱库和搜索软件附带的MS Interpreter应用程序也利用这些碎片离子的知识来进行NIST谱库检索，并帮助阐述化合的结构。
如表1所示，一些常见的碎片离子有多种可能，如28 Da可能是-C2H4、-CO、-N2中的任意一种，而29Da可能是-C2H5或-CHO等。虽然精确质量数的测定可能有助于区分这些可能的碎片，但我们想在本文中通过一个真实的例子来证明，在全谱图校正后，通过在MS的轮廓图模式中观察到的谱图差异，能更好地区分这些碎片，而且是在图形上更直观地通过视觉区分，而不仅仅是单点精确质量测定。此外，我们将展示来自同一分子离子(M+)的不同碎片如何在概念上和图形上通过谱图准确度（Spectural Accuracy）的概念联系在一起，用于结构说明和元素组成确定。![]()
1 实验部分：
样品信息：MS校准调谐气PFTBA （安捷伦GC/MSD自带），样品由天然产物制备质谱条件：PFTBA和样品均在MassHunter采集软件下以Profile模式采集，扫描速度为 2^2 (A/D samples = 4)，质量范围为 m/z 29-600，离子阈值Treshold设置为零。MS源温度230℃，四极杆温度150℃。
数据分析: MassWorks™ V6.0 软件(Cerno Bioscience公司) 对MS数据进行精确质量和谱图准确度测定。![]()
图1：通过外标法的PFTBA完成MS的精确质量和谱图校正![]()
2 结果：
对于图2中Rt=7.4 min的未知化合物，m/z为168，其精确质量为168.1416 Da的离子可能是分子离子(M+)，它将作为本次未知物鉴定的研究对象。使用图3所示的参数设置进行CLIPS检索会得到一个可能的元素组成的候选列表，如图4所示。排名第一的分子式(C11H20O+)和第二个分子式(C10H20N2+)的谱图准确度均超过99.0%，校准的MS谱图与理论MS谱图之间几乎完美匹配。第三名的分子式(C9H16N2O+)的谱图准确度仅为98.5%，在M+1附近存在明显的谱图误差，更具体地说，与校准的MS谱图在M+1附近不拟合，对应元素组成中因为少了两个碳原子使得M+1处的丰度较小。排名第一的分子式到第二的分子式，碳原子数量减少了一个碳(从C11H20O+的11个C减少到C10H20N2+的10个C)，M+1信号应该有明显的减少。但实际的结果表明，两个氮原子以及与之相关的来自15N的M+1信号的增加在某种程度上弥补了少一个13C的丰度降低，而第一个分子式中存在的一个氧原子由于其缺乏自然的17O同位素因而对M+1信号没有丰度贡献。
图3：MassWorks分析时CLIPS检索的参数设置
图4：按谱图准确度排序产生的候选分子式的CLIPS检索结果列表（上图），第一个候选分子式(中图)和第三个(底图)的校正谱图（红色）与理论谱图（蓝色）的叠加
43 Da 碎片丢失的鉴定
通过上述对M+ 离子的谱图准确度分析，包括各种较高丰度的同位素的分析，将可能的元素组成缩小到前2个候选分子式。其它 EI 碎片离子的存在，包括基峰m/z 125 离子，现在将被用于帮助确定元素组成，并阐明其可能的结构。利用所有可用的 EI 碎片和NIST谱库，可以轻松地执行谱库检索，结果如图 5 所示。虽然NIST检索给出的候选结果第1名确实与图4中CLIPS检索的第1名具有相同的元素组成，但其检索的匹配分值低于800，以及 m/z 125、69、55、41 和 27处的关键碎片上的无法匹配，这表明该化合物可能是NIST谱库没有收录的该分子式的不同同分异构体。有趣的是，NIST检索的所有前10个候选结果都包含至少一个氧，m/z 125的碎片离子的较高丰度要么与元素组成中的包含的多个氧原子有关，要么与化学结构中OH基团中包含的单个氧原子有关，这是关于该化合物结构可能范围的重要线索。图5：Rt =7.4 min 峰NIST检索结果表明该未知化合物在库中不存在，最高得分仅为789考虑到M+离子m/z 168和丰度最强的碎片m/z 125的质量差为 43 Da，参考表 1 所列的常见碎片，43 Da碎片似乎有两种可能，CH3CO (含氧)或CH3CH2CH2 (无氧)。CLIPS检索中可使用的Ion series分析来测量和比较这两种不同的可能性。未知分子要失去一个CH3CO碎片，首先必须包含至少一个氧原子，这就只剩下CLIPS结果中第1名的分子式C11H20O+成为可能。通过将从M+离子m/z 168至碎片离子m/z 125这一段的MS谱图作为一个整体进行谱图的拟合分析（见图6），就可以从图形拟合度上直接测量和评估整体的谱图准确度。在整体谱图准确度仅为97.0 %的情况下，M+ 的所有同位素都存在显著而系统的谱图漂移，丢失碎片CH3CO不太可能。此外，碎片离子m/z 125的“A +1”处可明显观察到理论谱图的丰度要高于实际的校正谱图，可能说明该理论谱图的分子式中的碳原子个数超过了真实的碳数，这表明丢失的43Da碎片是CH3CH2CH2 的可能性更大。图7显示了43 Da碎片丢失为CH3CH2CH2的谱图拟合结果，整体的谱图准确度为98.1%，M+在m/z 168处没有出现漂移，碎片离子m/z 125的“A+1”处也拟合完美，这清楚地表明CH3CH2CH2是正确的43 Da碎片丢失。![]()
图6：丢失CH3CO碎片情形下的校准谱图(红色)和理论谱图 (蓝色)的拟合比较，谱图准确度为97.0%图7：丢失CH3CH2CH2碎片情形下的校准谱图(红色)和理论谱图 (蓝色)的拟合比较，谱图准确度为98.1%在确认43Da碎片丢失为CH3CH2CH2后，CLIPS结果中的第1和第2个候选分子式，C11H20O+和C10H20N2+，都能产生该碎片，因此还是不能确定二者之中哪一个是正确的元素组成。在m/z 107 Da处的另一个较小碎片离子的存在可能有助于解决这个难题。该碎片与基峰m/z 125的质量差为18 Da，它可能是m/z 125进一步的碎片产物。根据表1中列出的常见片段，18 Da的丢失有一个明确的候选结果——H2O。图8显示了包含碎片CH3CH2CH2和额外的H2O丢失的整体谱图拟合结果，包括在更宽的MS范围(m/z 106~172)中，整体的谱图准确度为97.2%。谱图准确度偏低的主要是由于在这三个碎片离子之间还存在谱图干扰，例如，m/z 109, 111和132这三个含量很低的碎片离子并未参与刚才的谱图拟合建模，因而降低了整体的谱图准确度。m/z 109和111处离子的含量较低，猜测可能是由于丢失O和CH2，如图9所示，验证了这一假设，其谱图准确度提高到了97.6%。这就表明CLIPS结果中的排序第一的分子式——C11H20O，它是唯一可行的元素组成，其通过丢失一个氧原子来形成所观察到的这些碎片离子。图8：同时分析丢失一个CH3CH2CH2和一个额外的H2O的情况，校准谱图(红色) 和理论谱图 (蓝色)拟合的谱图准确度为97.2%![]()
图9：相较于图8，将m/z 109和m/z 111也加入谱图的拟合分析，校准谱图(红色) 和理论谱图 (蓝色)拟合的谱图准确度提高至97.6%
使用相同的方法，可以通过CLIPS的Ion series来特征分析其他较小的碎片或碎片簇，并确定它们各自的元素组成。图10显示了从C3至C8一系列的碳氢碎片的分析结果。将这些较小的碎片与之前分析过的较大碎片相结合，有助于拼凑出未知化合物的可能结构。![]()
图10：当使用CLIPS检索分析m/z 55附近的离子簇时，整体的谱图准确度达到了98.2%，以揭示出该处含有的可能的碳氢碎片，其他的离子簇也进行了类似的分析，并给出了碎片的结果
在NIST检索结果中找不到合理的碎片离子匹配结果，而MassWorks软件的CLIPS检索结果已经给出了分子离子和碎片离子的可能元素组成，我们借助ChemSpider数据库对可能结构进行检索(见图11)，该化合物的可能结构很可能与ChemSpider检索结果中的第二个结构非常相似。正确的分子可能是包含一个通过连接到碳上的OH基团的单个氧原子，位于碳氢链的中间或接近末端，其余的碳氢链包含最多8个碳(最大的碎片为m/z 107，如图10所示)。即使在NIST等标准谱库中没有收录目标化合物，通过将MassWorks软件中的CLIPS Ion series分析和其他网络搜索(如ChemSpider)相结合，也可以帮助拼凑出未知化合物的可能结构类型，以供进一步研究或考虑。需要注意的是，在EI硬电离的模式下，分子离子有可能被完全打碎，使得未知化合物的质谱谱图中没有分子离子，这种情况下，为了更好地鉴定未知物，就需要考虑用软电离的模式，如CI、FAB等电离方式，获取分子离子。
关于MassWorks 软件
MassWorks软件是由 Cerno Bioscience 公司开发的一款革命性的MS数据定性分析软件，能帮助我们在低分辨率的四极杆GC/MS、LC/MS直接测定化合物的精确质量，并通过独有的谱图准确度概念确定出准确的分子式。MassWorks软件同样适用于高分率质谱（TOF、Orbitrap）的定性分析。
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