中草药研究，SCI发表策略

学术 2024-11-05 07:03 北京

研究中草药难发SCI？且看小编推荐的这篇发表在Journal of Ethnopharmacology （IF 5.4）上的文章，通过两种中药配伍结合网络药理学及生信分析等多种手段研究其对疾病治疗的潜在机制。体会宝藏思路（多种中药结合+生信手段+疾病机制），发精彩文章！

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在本研究中，作者首先通过网络药理学的方法，预测了大血藤（Sargentodoxa cuneata）-攀倒甑（Patrinia villosa）对治疗结直肠癌（CRC）的作用靶点及方式。同时，利用GEPIA、HPA和cBioPortal数据库检测了核心靶点在CRC组织中的表达。随后，通过分子对接和细胞实验相结合的方法对上述结果进行了验证：大血藤-攀倒甑可能通过PI3K/AKT/mTOR信号通路促进CRC细胞凋亡。

背景

结直肠癌（CRC）发病率位居全球第三，死亡率位居全球第二。早期很难诊断，一旦发现即中晚期。根据中医原理，CRC主要影响大肠，与脾胃密切相关，临床上常表现为血瘀证。因此，中医在治疗大肠癌的过程中，经常加入一些促进血液循环、化瘀的草药。大血藤（Sargentodoxa cuneata）和攀倒甑（Patrinia villosa）都具有活血化瘀的作用，现代药理研究证实了它们的抗肿瘤作用。虽然前人已经揭示这两个物质的抗癌活性，但关于其有效成分及作用机理仍然不得而知。

本研究在网络药理学、分子对接技术、肿瘤数据库检索、细胞实验的基础上，挖掘了大血藤-攀倒甑的15种有效成分，并论证了该草药配伍可通过多途径、多靶点在CRC治疗中发挥重要作用，为中医药治疗CRC提供了客观依据。

研究思路

结果

1.草药和CRC的共同靶点

作者首先将草药成分、靶点等相关信息整合并上传到Cytoscape 3.9.1，构建草药-成分-靶点网络，筛选出255种草药作用靶点（图1）。同时，作者在Genecards数据库、OMIM数据库、DisGeNET数据库、Therapeutic Target数据库中搜索与CRC病理过程相关的靶点，共6113种疾病靶点。

图1：草药成分-靶标网络图。

随后，作者利用TCMSP平台筛选出该中药的15种有效成分（表1）。

表1：大血藤-攀倒甑草药的生物有效成分。

最后，作者使用生物信息学工具识别出大血藤-攀倒甑与CRC之间的共同靶点，发现了66种草药-疾病的共同靶点（图2）。

图2：大血藤-攀倒甑具有66个与CRC相关病理过程的共同靶点.

2.共同靶点的PPI网络

随后，作者对66个共同靶点进行PPI分析，根据其度值（AKT1:39, EGFR:31, CASP3:31, SRC:31, ESR1:30, MDM2:23, ANXA5:22, PPARG:19, KIT:13, GSK3B:15）确定了前5个靶点。作者发现这些在网络中连通性最高的关键靶点是AKT1、EGFR、CASP3、ESR1和SRC，并构建了一个具有64个节点和296条边的PPI网络(图3)。

图3：蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)分析网络图。

3.共同靶点的GO和KEGG的富集分析

随后，作者对共同靶点进行了GO和KEGG分析。GO分析结果显示：共同靶点涉及725个生物过程，28种细胞成分和77种分子功能（图4A-C）。

KEGG 富集分析共发现 101 条通路，排名前十的通路分别是癌症中的通路、PI3K-AKT 信号通路、Ras 信号通路、表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂抗性、ErbB 信号通路、病灶粘附、化学致癌-活性氧、Rap1 信号通路、MAPK 信号通路、癌症中的中心碳代谢（图 4D）。

图4：GO和KEGG富集分析气泡图。

4.网络拓扑分析

在随后的通路-靶点拓扑网络结果中显示，度值最高的通路是 hsa05200：癌症中的通路，度值最高的靶标是 AKT1（图5）。这进一步表明大血藤-攀倒甑对癌症通路中的AKT1有显著影响。

图5：通路-靶标网络的可视化；矩形代表通路，椭圆形代表靶标。

5.分子对接

为了进一步确认中草药有效成分与CRC可能结合的模式，作者进行了分子对接分析。结果显示，双氢愈创木脂酸（DXT02）与核心靶标AK-T1、表皮生长因子受体（EGFR）、CASP3 和 ESR1 的有良好的对接（受体和配体之间至少有两个氢键），与核心靶标 SRC 有适度对接（受体和配体之间有一个氢键）（图6）。

图6：分子对接相互作用图和二维图。

6.生物信息结果分析

在明确核心靶标及作用模式后，作者通过查阅相关数据库得知关键靶点在CRC的表达水平及预后情况。

根据 GEPIA 数据库的分析结果，CASP3 在 CRC 组织中的 mRNA 表达水平显著增加（P < 0.05）（图 7A）。对包括 AKT1、EGFR、CASP3、ESR1 和 SRC 在内的关键靶点进行的生存期研究显示，其预后价值没有显著差异（图 7B）。此外，对核心靶标mRNA水平与CRC病理分期的关联分析显示，AKT1、EGFR、CASP3、ESR1和SRC的表达水平与病理分期无显著差异（图7C）。

图7：核心靶点mRNA表达水平分析图、生存分析图、病理分期图。

HPA 数据库的研究结果显示，EGFR和 CASP3 在正常组织和结直肠癌组织中的表达不同。此外，SRC的表达水平中等，ESR1的表达水平较低，而AKT1的表达水平较高（图 8）。

图8：HPA数据库中AKT1、EGFR、SRC、CASP3、ESR1的表达水平。

通过使用 cBioPor-tal 分析工具，作者发现 594 例患者中有 337 例在上述五个核心靶点上发生了各种突变（图 9C）。同时，作者检测了594名患者这五个核心靶点的遗传变异图谱（图 9A）。图9B显示了不同类型CRC中与基因改变相关的5个核心靶点。多组数据显示，SRC在多种结直肠癌患者中更容易发生基因突变(32%)。

图9：核心靶点遗传信息分析图谱。

7.双氢愈创木脂酸可抑制 HT29、HCT116 和 CT26 细胞的增殖

在确定双氢愈创木脂酸这一关键有效成分后，作者通过CCK8实验发现该成分对HT29、HCT116和CT26细胞有不同程度的抑制作用。双氢愈创木脂酸抑制作用随浓度和处理时间的增加而增强，并且其对不同的CRC细胞具有不同程度的毒性（图10）。

图10：双氢愈创木酸降低结直肠癌细胞的活力。

8.双氢愈创木脂酸诱导 HT29 细胞和 HCT116 细胞凋亡

Annexin V-Alexa Fluor 647/PI双染色检测结果表明，在50和100μM/mL浓度下，双氢愈创木脂酸可诱导HT29细胞和HCT116细胞凋亡。而且，两种细胞的凋亡水平随着浓度或时间的增加而增强（图 11）。

图11：双氢愈创木酸促进结直肠癌细胞凋亡。

9.双氢愈创木脂酸通过PI3K/AKT/mTOR 通路抑制CRC

通过前述生信分析发现双氢愈创木脂酸是一种能够靶向5个核心蛋白的化合物，并且可以抑制结直肠癌细胞的PI3K/AKT/mTOR通路及细胞的凋亡，因此，作者进一步验证了双氢愈创木酸是否是通过抑制该信号通路抑制了HCT116 和 HT29 细胞的凋亡。

结果如图12所示，双氢愈创木脂酸干预后，两种类型的结直肠癌细胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 和 p-MTOR/MTOR 的值明显低于对照组，而 BAX/BCL2 的值则明显高于对照组。因此，双氢愈创木脂酸可以通过抑制PI3K/AKT/mTOR 通路促进 HT29 和 HCT116 细胞凋亡。

图12：双氢愈创酸调节结肠细胞BCL2、BAX和PI3K/AKT/mTOR信号通路的蛋白表达。

讨论

本研究通过网络药理学和生物信息学分析，结合分子对接和细胞实验，预测和验证了大血藤-攀倒甑中草药配伍对治疗CRC的作用机制。作者在最后成功锚定了双氢愈创木脂酸这一关键有效成分，以及PI3K/AKT/mTOR这一主要靶标信号通路。

在研究思路上，除了使用传统的网络药理学预测靶点及湿实验验证，作者在这里还有效地利用了3种肿瘤数据库：GEPIA、HPA、cBioPortal数据库。这些数据库对进行肿瘤研究的科研人员有很大的利用价值，小编在这里对他们的用途进行了总结。巧妙地使用这些肿瘤数据库不仅可以可视化靶标基因在肿瘤组织中的表达，而且可以为研究者提供重要的临床相关性分析，更加丰富了文章的论证依据。

数据库	网址	用途
GEPIA	http://gepia.cancer-pku.cn/	Ø 不同肿瘤类型中的不同基因表达情况； Ø 查找靶基因在对应肿瘤不同阶段的表达差异； Ø 生存曲线分析； Ø 分析两个基因之间的相关性。
HPA	https://www.proteinatlas.org/	Ø 基因/蛋白在细胞、正常组织和癌变组织中的表达图谱； Ø 生存曲线分析。
cBioPortal	https://www.cbioportal.org/	Ø 基因突变分析与可视化； Ø 生物通路探索； Ø 生存分析； Ø 基因组改变之间的互斥性分析。

原文地址：10.1016/j.jep.2023.117342

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