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1、原位PCR技术和原位杂交技术
原位PCR技术起源于传统PCR技术和原位杂交技术，是在组织细胞里进行PCR反应的技术。
原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。
原位杂交技术具有良好的组织定位能力，可以揭示出目的片段与目的组织之间的关系，但其敏感性较低，对低浓度的目的基因检测能力较差。
原位PCR技术成功地结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异灵敏的PCR技术的优点，既可以对含有目的片段的组织或细胞进行精确的定位从而揭示出目的片段与组织或细胞间的形态结构信息，又由于其具有高度的敏感性可以检测出组织或细胞中低浓度的DNA或RNA，成为了细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术。
原位PCR被广泛用于鉴定细胞内功能基因的发生及表达，应用于内源基因检测、外源基因检测、病原体检测、基因突变、基因重排和染色体移位、基因变异的鉴定和基因表达的研究等方面。
2、原位PCR的基本原理
原位PCR技术的待检标本一般先经化学固定，以保持组织细胞的良好形态结构。
细胞膜和核膜均具有一定的通透性，当进行PCR扩增时，各种成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可进入细胞内或细胞核内，以固定在细胞内或细胞核内的RNA或DNA为模板，于原位进行扩增。
https://www.detaibio.com/topics/pcr.html
扩增的产物一般较大，或互相交织，不易穿过细胞膜或在膜内外弥散，从而被保留在原位。这样原有的细胞内单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指数极扩增，扩增的产物就很容易被原位杂交技术检查。
图片来源：fish(荧光原位杂交)技术
原位PCR在不破坏细胞的前提下利用原位完整的细胞作为微量反应体系，通过扩增细胞内的靶片段来进行检测，既有高度的特异性又可精确的定位，实现了目标物在分子水平上的原位检测和定量研究。
3、原位PCR的分类
根据在扩增反应中所用的三磷酸核苷酸原料或引物是否标记，原位PCR技术可分为直接法和间接法两大类，此外，还有反转录原位PCR技术等。
直接法原位PCR即在反应体系中直接使用标记的单核苷酸或引物；而间接法原位PCR所用引物和单核苷酸都不带任何标记物，待反应结束后再用原位杂交技术检测特异性扩增片段产物。
现在临床上使用最多的是间接法原位PCR，相对于直接法原位PCR，它的特异性更高。
1）直接原位PCR
在进行原位扩增之前，把用同位素、生物素或地高辛 标记的三磷酸核苷酸或引物加入反应体系中。
图片来源：用于修饰与放射性标记核酸的酶_挂云帆
原位PCR的标记物的有非放射性标记和放射性标记两种。非放射性标记包括如地高辛、生物素、过氧化物酶等，放射性标记多采用放射性同位素³²P、³H等。
图片来源：网络
随着核算扩增的进行，标记的核苷酸或引物直接掺入到产物中，PCR反应产物用放射性自显影、免疫组织化学反应或荧光检测技术进行特异核酸序列的检测及定位。
图片来源：网络
直接原位PCR具有操作简便、流程短、省时的优点，但直接原位PCR易发生引物错配或非特异性退火，易出现假阳性，扩增效率也较低，特别是在石蜡切片上。
图片来源：第二节石蜡切片制作ppt
因为在制片过程中，无论是固定，脱水还是包埋，都会导致DNA的损害，而受损的DNA可利用反应体系中的标记三磷酸核苷酸进行修复，这样标记物就会掺入到DNA的非靶序列中，造成假阳性。若用标记引物的方法进行直接法原位PCR，其扩增的效率比不标记更低。
2）间接原位PCR
间接法原位PCR与直接法不同的是，反应体系与常规PCR相同，所用的引物或三磷酸腺苷酸均不带任何标记物。
间接法原位PCR先对细胞内的目的基因进行原位扩增，再用带标记的探针对特异性扩增的产物进行核酸分子原位杂交，以检测及定位扩增的目的基因。
图片来源：新型寡聚核苷酸荧光原位杂交：发展与应用
http://journals.caass.org.cn/zwyczyxb/CN/10.13430/j.cnki.jpgr.20220801001
原位杂交中所用的探针可特异性地与扩增产物的靶序列杂交， 即使扩增产物中有非靶序列成份，它们也不会呈现阳性反应，克服由于DNA修复或引物错配引起的非特异性问题，是目前应用较广泛的靶核苷酸序列原位扩增技术。
但该法需制备探针进行原位杂交检测结果，检测时可能会受到探针大小的制约，且需要进行扩增反应后的洗脱和原位杂交过程，与直接法原位相比，该方法相对繁琐，耗时长。
3）原位反转录PCR
原位反转录PCR是指在进行PCR之前首先进行反转录，将反转录的产物作为模板用于扩增。原位反转录PCR可用于检测细胞或组织切片中各种病毒RNA或mRNA。
进行原位反转录PCR反应之前，组织标本要先用DNA酶处理，以破坏组织中的DNA酶，这样才能保证扩增的模板是从mRNA反转录合成的cDNA，而不是细胞中原有的DNA。
4）原位环式等温扩增
基于等温扩增的原位环式等温扩增技术，其比变温原位PCR穿透处理条件温和，细胞不易破碎；独特设计的环状引物使扩增产物分子量大，不易扩散，扩增温度低且恒定，不使用PCR仪，细胞损失率大大降低。
图片来源：一种基于RNA序列特异内切扩增的组织原位RNA单分子成像方法
https://www.xjishu.com/zhuanli/27/202310523155.html
3、原位PCR技术流程
原位PCR技术流程可以分为四个关键步骤：细胞固定、蛋白酶消化、原位PCR扩增和PCR扩增产物检测。
1）细胞固定
为了保护细胞的形态结构，需要通过福尔马林、多聚甲醛、丙酮等固定剂来对细胞进行固定。通过使蛋白质凝集、核酸交联，从而形成有效的限制产物扩散的网络性屏障，以保证细胞不被破坏。
一般认为组织细胞以10%的缓冲福尔马林或4%的多聚甲醛固定后进行原位PCR效果较好。固定的时间一般不宜过长，视组织的大小，一般以4℃4-6小时为宜。组织固定时间越长，DNA链断裂基因片段断裂程度越大，能扩增的基因片段越短。
图片来源：常用混合固定液的种类与配方（二） - 病理杂谈 - 91360病理论坛
https://bbs.91360.com/forum.php?mod=viewthread&tid=72619
福尔马林长期暴露在空气中会被氧化成甲酸，而DNA易被甲酸降解，在固定细胞时应使用新鲜的福尔马林溶液。
图片来源：乙醛的催化氧化反应原理-百度经验
https://jingyan.baidu.com/article/8ebacdf07b750708f65cd5aa.html
若选用甲醛固定则必须选用蛋白酶消化，通过乙醇和丙酮固定不宜使用蛋白酶消化，否则会影响灵敏度。
2）蛋白酶消化
使用醛类固定剂对细胞形成网络性屏障的同时，一定程度上妨碍了PCR反应过程中所需试剂进入细胞，难以与靶DNA接触。因而需要对固定细胞进行消化，增加其通透性，充分允许反应体系中的各成分进入细胞内，并能很好的暴露靶序列，以利于扩增。
图片来源：BL104B 蛋白酶K溶液 (20mg/ml)
http://www.biosharp.cn/index/product/details/language/cn/product_id/1171.htm
常用的蛋白酶有蛋白酶K，胰蛋白酶或胃蛋白酶。蛋白消化的强度应该与组织的固定程度相适应。
若蛋白酶K消化时间过短、酶浓度过低，很难进行有效的扩增，易出现假阴性。消化时间过长、酶浓度过高，组织细胞的通透性过高，扩增的产物会向细胞外弥散，导致定位不准确或出现假阴性的情况。
在实验前应使用不同浓度蛋白酶K和消化时间进行试验，组织结构模糊的前一个浓度为该组织的最佳消化条件。
蛋白酶消化后，要注意加热以灭活酶的活性或通过充分的洗涤将酶完全去除，因为只要有少量的残留酶存在，都将对随后进行的PCR反应体系的数量TaqDNA酶产生毁灭性的影响。
3）原位PCR扩增
原位PCR扩增是在玻片上或Eppendorff管中进行的，使用引物对细胞内的DNA或RNA进行选择性扩增。其中对RNA进行扩增需要先将其转录成 cDNA后进行PCR循环扩增。
图片来源：小鼠脑切片原位杂交 —BIO-PROTOCOL
https://cn.bio-protocol.org/mv2/e1010818
原位PCR扩增的成功应具备以下条件，即足够的扩增效率、避免引物错配、扩增产物尽可能保留在原位。
原位PCR技术可应用于细胞悬液、细胞涂片、冰冻切片以及石蜡切片。相比较而言，以悬浮的完整细胞做原位PCR效果最好，石蜡切片效果最差。
图片来源：石蜡切片碎掉的蜡块可以重新包埋吗？
https://www.uptbio.com/news/view/420.html
切片效果不好的原因是多方面的，如：玻片上做PCR，热传导较差，热对流不均匀，Taq DNA聚合酶被玻璃片吸附等，更为主要的原因，可能是标本经制片后，细胞缺乏完整的胞浆或核膜，扩增产物易发生弥漫而导致扩增的产物在原位不易保留。
玻片会对酶活性产生一定的影响，因此试验使用的酶浓度应稍大一些，每一个保温时间都相应地稍长一些。另外小牛血清蛋白可降低玻片对酶的影响，也可使用小牛血清蛋白封闭来减少酶的用量。
一般而言，切片若厚一些，原位PCR的效果也较好一些，因为切片越厚，靶DNA的含量也就越多，同时膜结构也较多，防止扩增产物弥散的作用也越明显。但厚切片细胞重叠多，形态学观察的效果就差了，分辨率也将下降。
实操视频 | 石蜡切片制作之切片与展片的具体实验步骤与注意事项
https://m.sohu.com/a/731118302_121807994/?pvid=000115_3w_a&strategyid=00014
为防止石蜡切片在PCR和原位杂交过程中脱落，在玻片应作防脱片处理，常用的方法是涂以多聚赖氨酸或用硅烷化处理，一般能防止组织脱落。
原位PCR宜用较短的引物，因为组织固定一般会对DNA链造成一定损伤，较长序列的扩增易引起引物与模板的错配而导致非特异性反应的出现。
PCR扩增可采用热启动法提高检测特异性，热启动原位 PCR可以有效减少引物与模板错配。
https://www.zhihu.com/question/338474381?utm_id=0
原位PCR的热循环可在专门的热循环仪上进行，操作简便。也可在一般的PCR热循环仪上进行，通常在样品台上覆盖一层铝箔，制成平台，样品台上的空间用矿物油或水充填，将载玻片至于平台上，即可进行热循环的步骤。
https://m.chem17.com/product/detail/32419327.html
内源性DNA损伤的DNA修复是假阳性结果的常见原因。在组织切片中这种DNA损伤后，Taq聚合酶在修复过程中结合标记核苷酸，可能造成假阳性。试验中使用不含外核酸酶的DNA聚合酶，可以尽量避免Taq聚合酶在修复过程产生的假阳性。
为了保证反应体系在热循环过程不过多丢失，可用清亮的指甲油，矿物油或PAP笔把盖片四周封闭起来。
4）扩增产物检测
根据检测方法和标记物性质的不同，可分别采用DNA分子原位杂交技术、放射自显影、免疫组化、荧光镜检等方式对扩增产物进行检测。
扩增产物可能在细胞间弥散，需要对玻片进行适量振洗，避免背景干扰，洗涤的程度要兼顾减低背景和保留强阳性信号。
PCR时使用多对引物扩增，得到长度不同的扩增产物，产物相互交织于原位固定，可有效防止扩增产物弥散，产生假阳性。
参考文献：
［1］PCR 实战宝典 No.8：原位PCR-仪器信息网
［2］原位PCR原理与操作步骤 - 英格恩生物技术博客
进行业群
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