2024年11月28日，北京大学药学院天然药物及仿生药物全国重点实验室刘涛教授团队联合中国地质大学（武汉）娄筱叮教授团队在Nature Chemistry期刊上发表了题为“Designing Artificial Fluorescent Proteins and Biosensors by Genetically Encoding Molecular Rotor-based Amino Acids”的研究成果。
北京大学药学院刘涛教授和中国地质大学（武汉）娄筱叮教授为研究论文的共同通讯作者。北京大学药学院博士研究生胡利明（2024年毕业）、中国科学院深圳先进技术研究院博士后曹文兵为论文的共同第一作者。
荧光技术是分子生物学研究中的核心工具， 尤其是荧光蛋白 （如绿色荧光蛋白 GFP），凭借其可遗传编码性、丰富的色彩变化和出色的稳定性，为研究生物分子的定位、相互作用及动态行为提供了强有力的支持。然而，传统的荧光蛋白仍面临一些显著挑战：它们的分子体积较大（通常超过20kDa），需要与目标蛋白进行末端融合，且可能干扰蛋白的天然功能和定位。此外，传统的荧光传感器多依赖于融合标记蛋白或荧光染料，这些方法在活细胞环境中的适应性和信噪比往往不佳，限制了其广泛应用。针对这些瓶颈，该研究团队受到荧光蛋白发色团的化学特性的启发，设计了一类荧光分子转子型氨基酸 （Fluorescent Molecular Rotor Amino-acid, FMR-AA）。通过结合遗传密码子扩展技术，团队成功将FMR-AA以点突变的形式引入目标蛋白。这一全新策略融合了荧光蛋白的可遗传编码优势与化学染料分子的微型化和拓展性，不仅能简便高效地构建各种人造荧光蛋白，还能开发出高灵敏度的生物传感器，是生物成像和分子检测技术的新突破。
FMR-AA拥有一种特别的“隐身”能力。在溶液中，它保持非荧光状态，一旦进入高粘度环境或折叠成熟后的蛋白质中，它便能被激发出明亮的荧光。因此，该研究团队突破了传统荧光蛋白的β-桶结构限制，将FMR-AA引入到任意天然蛋白质中，并通过蛋白进化和筛选，成功获得了具有和GFP相同荧光原理的全新荧光蛋白。这些人造荧光蛋白在结构和尺寸上展现出多样性，其中最小的结构仅为7kDa。随后，他们还在细菌和哺乳动物细胞中验证了这些人造荧光蛋白免洗的动态成像能力，为生物成像技术打开了新的大门。
经典的遗传编码荧光蛋白生物传感器通常依赖于复杂的构建方法，如循环重排荧光蛋白（Cp-FP）或利用两个融合荧光蛋白之间的FRET效应。这些方法往往需要繁琐的接头序列筛选和优化，耗时且挑战重重。而FMR-AA的微环境敏感性为生物传感器的开发提供了一条简便且高效的新路径。该团队利用FMR-AA成功开发了多种蛋白质荧光生物传感器，能够实时监测蛋白质构象变化、蛋白质-蛋白质相互作用以及细胞内代谢物的动态变化。例如，他们将FMR-AA引入到钙调蛋白（CaM）的关键位点，经过简单的改进和优化，成功构建了一种高信噪比、快速响应的钙离子传感器。这款传感器能够在哺乳动物活细胞中实时监测钙离子浓度的动态变化。利用这一通用策略，该团队还设计了可以灵敏检测葡萄糖、GTP和谷氨酰胺浓度的荧光传感器，拓展了FMR-AA在生物检测中的应用。此外，该团队还展示了FMR-AA作为动态探针检测蛋白质相互作用的独特能力。还展示了FMR-AA用作检测蛋白质相互作用的动态探针的能力。他们将FMR-AA引入到FRB和FKBR这两种经典的相互作用蛋白的结合界面，通过荧光信号的变化实现了对这两种蛋白质相互作用过程的实时监测。该方法在体外抗原抗体相互作用和活细胞水平蛋白质互作上均表现出极高的灵敏度，为分子生物学中的蛋白质互作研究提供了更为精确和高效的检测手段。
综上所述，该研究在技术上突破了传统荧光蛋白和生物探针开发方法的局限，展现了小型化、灵活性和简便性的优势，同时具有广泛的适用性和优异的信噪比，尤其在活细胞动态观测中表现出色。这项技术不仅推动活细胞成像、生物分子互作研究及代谢物检测等领域的发展，还为分子可视化工具的定制化开发开辟了新的方向。随着技术的不断完善，FMR-AA有望为揭示复杂生命过程提供更加高效、易用的研究工具，为生命科学研究带来新的突破。
该工作得到科技部重点研发计划和国家自然科学基金委等项目资助。
相关论文信息：
https://doi.org/10.1038/s41557-024-01675-x
编辑 | 何晴
排版 | 胡妙妙
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