默沙东案例2｜验证Emulate肠道芯片用于预测BCS I-IV类药物肠道吸收特征

本研究中，Transwell系统和微流控芯片系统中测定了所有19种原料药（17种原料药和2种荧光标记物）的渗透性。默沙东的科学家们选择了渗透性分为高、中、低和零的原料药来建立线性关系。首先测定了在Transwell模型上培养的表观渗透性（Papp）（图4A）。发现高渗透性原料药（fa≥85%）的Papp比中低渗透性原料药（fa<85%）高出近两个数量级。高渗透性原料药的Papp介于2.3至4.3×10-5厘米/秒之间，而中低渗透性原料药的Papp介于5.9至28.9×10-8厘米/秒之间，氯苯那敏（3.7×10-5厘米/秒）除外。将低度（fa<50%）与中度（fa=50-84%）进行比较，结果在相同数量级内。在整个实验过程中，对API试验前和试验后处理中的TEER进行了屏障完整性监测。根据图4B，量化了相对于处理前时间点的TEER。归一化的TEER数据与之前的MTS数据相结合，表明Caco-2单层在转运试验期间并未受到API培养的显著影响。此外，还使用两种惰性荧光旁细胞标记物--LY（MW=444Da）和FD3（MW=3kDa）验证了这些结果。这些标记物显示了分子大小受限的Papp，与已有数据相符：FD3 Papp为7.9×10-8cm/s，LYPapp为49.9×10-8cm/s。

图4.在Transwells上培养的Caco-2单层上测量的小分子原料药渗透性。

(高浓度API与中低浓度API和零浓度API相比，渗透率相差500倍。(B)培养后归一化TEER（相对于0分钟）在Transwells中测量单层完整性。TEER表明暴露于各种API后上皮屏障健康。白条代表未处理状态。N=最少3人，数据为平均值±SEM。

在Emulate肠道芯片模型中，在连续流动7天后，默沙东的科学家们评估了FD3（0.1毫克/毫升，在TB中流动4小时）的渗透性。这项测量可作为质量控制，以确定渗透性是否在<5×10-7厘米/秒的阈值范围内，并确认屏障的完整性。用FD3确认阻隔完整性后，17种原料药溶液以125µL/hr的速度通过芯片灌流（图5）。将芯片中的高渗透性化合物与低渗透性原料药进行比较时，两者的范围相差不到40倍（安替比林与纳多洛尔）。这比Transwell条件下的差异范围要小，后者的差异超过500倍（安替比林与纳多洛尔）。对于Transwells和芯片渗透性研究，默沙东的科学家们比较了各自培养模型中的原料药，如安替比林[高]（Transwells：3853.05×10-8cm/s VS芯片：3294.82×10-8cm/s）、依那普利[中]（Transwells：10.18×10-8cm/s VS芯片：118.42×10-8cm/s）和依那普利拉[低]（Transwells：5.87×10-8cm/s VS芯片：73.76×10-8cm/s）。默沙东的科学家们使用LY和FD3作为基于尺寸的渗透性标记进一步验证了这些结果。这些标记与Transwells和文献报道的趋势相同：FD3 Papp24.1×10-8cm/s，LYPapp138.8×10-8cm/s。渗透性的差异表明流体剪切应力是影响人体肠上皮细胞药物吸收的关键特性之一，并能改变人体口服药物吸收与Caco-2细胞Papp的相关性。

图5.在Emulate肠道芯片中培养的Caco-2细胞暴露4小时后测量的小分子原料药渗透性。

从高渗透性API到零渗透性API的范围比在Caco-2 Transwells中观察到的范围小10倍。N=最少4个，数据为平均值±SEM。

图6A绘制了小分子在Transwells（圆形）和Emulate肠道芯片（方形）中的人体吸收率（fa；从已公布的临床数据中获得）和实验Papp。由于依那普利、依那普利拉、法莫替丁、利辛普利和特布他林没有临床数据，改为将化学结构（mol文件）导入GastroPlus9，并对这些化合物使用预测的fa。根据结果，Transwells的数据分布范围比Emulate肠道芯片更广，即从0.04×10-6厘米/秒到43.5×10-6厘米/秒，而Emulate肠道芯片的数据分布范围较小，从0.30×10-6厘米/秒到32.9×10-6厘米/秒。比较培养模型，使用一系列fa值绘制了Emulate肠道芯片（图6B）和Transwells（图6C）的四条非线性半回归线。基线值（紫色）来自初始fa数据集和GastroPlus的补充值。GastroPlus值（黑色）是使用GastroPlus9预测的所有化合物的fa值。Pham-Thefa值（绿色）来自辅助信息。组合数据集（红色[Chip]或蓝色[Transwell]）是基线值和Pham-The数据集的组合，以提供最完整的数据集。fa值的详细选择见表S3。对于芯片，基线产生了一条非线性半对数回归线，即y=-27.43+37.78log(x)，相关系数为r2=0.79。GastroPlus值的半对数拟合为y=25.65+10.17log(x)，r2=0.41。Pham-The的y=-26.84+35.39log(x)，r2=0.65。综合数据集的y=-31.75+37.48log(x)，r2=0.66。对于Transwells，基线半对数线拟合值为y=7.93+24.97log(x)，r2=0.82。GastroPlus值为y=18.14+35.74log(x)，r2=0.59。Pham-The的y=11.42+23.55log(x)，r2=0.83。综合数据集的y=9.27+24.71log(x)，r2=0.83。在Transwells中，r2值在0.59-0.83之间，而Emulate肠道芯片的r2值在0.41-0.79之间。数据表明，与黄金标准的Caco-2Transwell模型相比，在芯片中培养的Caco-2细胞具有更宽的IVIVC范围，但预测程度相对相似，均可作为黄金标准。

图6. Transwell和芯片系统中人体吸收度的比较。

(A)小分子API的渗透性测量值与文献中的人体fa数据对比图，显示一些小分子（依那普利、赖新普利和美托洛尔）的渗透性在Transwell和芯片中存在明显差异。(B)Chip系统对Baseline（紫色）、GastroPlus（黑色）、Pham-The（绿色）和Combined（红色）fa（%）数据集的Semilog线性拟合得出的r2线性范围为0.41--0.79。(C)Baseline（紫色）、GastroPlus（黑色）、Pham-The（绿色）和Combined（红色）fa（%）数据集Transwell系统的半对数拟合线表明线性范围r2为0.59-0.83。符号：填充=高渗透性，半填充=中等渗透性，空=低渗透性API。N=最少3个，数据代表平均值。

口服给药被认为是最受患者青睐的给药途径，但药物必须具有足够的可溶性和渗透性，才能成功配制出口服制剂。目前在预测可溶性的工具开发中已经取得了不少进展，但针对渗透性检测开发的工具还没有像黄金标准的Caco-2 Transwell检测法那样经过广泛验证。本研究中，默沙东的科学家们使用19种具有代表性的生物制药分类系统（BCS）I-IV类化合物，在Transwells和商业化的Emulate肠道芯片中对Caco-2肠道渗透性检测进行了评估。对于每种选定的化合物，默沙东的科学家们都进行了全面的活力测试，量化了其表观渗透性（Papp），并在两种培养条件下建立了与人体吸收部分（fa）的体内外相关性（IVIVC）。与历史数据相比，本研究开发的Emulate肠道芯片Papp数据更接近于原生组织。本文是第一项全面验证商业化肠道芯片模型作为评估口服吸收的预测工具的研究，以进一步减少药物开发对动物模型的依赖。