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很高兴与大家分享一篇近期由韩国化学技术研究所（KRICT）发表的一篇论文，该论文使用Emulate器官芯片技术重建具有血脑屏障功能的BBB芯片，并产生测试了10种不同药物穿透BBB的渗透性，提出了各参数之间的线性关系，有望进一步用于神经药物开发。血脑屏障（BBB）是大脑中的一层选择性半透膜，由选择性紧密连接组成，封锁了中枢神经系统（CNS）。人体 BBB 由微血管内皮细胞（EC）、周细胞、星形胶质细胞、紧密连接和基底膜组成。星形胶质细胞和周细胞支持屏障功能，并与内皮细胞相互作用，在生理和病理条件下维持和控制血管的完整性。设计具有高 BBB 通透性的神经药物挑战很大，且成功率低，主要障碍是药物无法穿过 BBB 导致中枢神经系统暴露不足。只有分子量小于 400 Da 的脂溶性小分子才能穿过 BBB，大多数大分子都不能。这一生理障碍阻碍了 95% 治疗神经系统疾病药物的开发。
当前血脑屏障的大多数体外模型是二维（2D）Transwell 系统。在细胞培养板的可渗透膜上培养心血管细胞，从而监测屏障的通透性。然而，Transwell 模型缺乏细胞外基质（ECM）和液体流动，因此不能准确模拟 BBB 微血管。相比之下，微流控系统采用可变的三维（3D）结构，通过液体灌注为细胞提供持续的营养和氧气，从而近似模拟人体环境。而动物模型虽为复杂个体模型，但在检测方法和获取组织方面有其局限性，并且存在物种转化差异，药物在动物上的反应与人体的反应大相径庭。由于成本和伦理问题，以及为了减少动物在研究中的使用，人们一直在努力开发三维体外模型，如器官芯片系统。确切地说，器官芯片是一种多通道微流控装置，与细胞培养相兼容，可体外模拟类似于特定器官的物理和生理功能，可在与生理相关的机械环境中进行药物筛选和递送研究。本研究将基于Emulate的血脑屏障（BBB）芯片，通过 LC-MS/MS 分析待测化合物，揭示BBB 的渗透性。我们将从两个方面进行介绍：(1) BBB 的体外模型和表征；(2) 利用模型预测 BBB 的通透性。
利用微流体芯片的测试模型可以通过对 BBB 施加剪切应力来模拟人体内的物理刺激。通过同时培养构成 BBB 的各种细胞，这些模型可实现细胞间的相互作用，重现类似生理 BBB 的功能。这些 BBB 芯片可用于在与人体相似的环境中构建各种脑疾病模型，可用于中枢神经系统药物开发。在本研究中，使用了经过充分验证的Emulate器官芯片来研究 BBB 的结构和功能。利用已建立的 BBB 芯片，我们的研究旨在以更贴近人体真实反应的方式预测药物在临床前药物开发阶段的血脑屏障渗透性。为此，我们选择了之前报道过的具有血脑屏障通透性的药物，并建立了药物血脑屏障通透性的测试方法。为了建立人血脑屏障（BBB）芯片，我们将人脑微血管内皮细胞hBMECs 引入Emulate 器官芯片的底部通道，将星形胶质细胞（Astrocytes）和周细胞（Pericytes）引入顶部通道，接种后持续培养和观测（图1）。![]()
图 1. 体外人血脑屏障（BBB）模型构建流程图。人血脑屏障（BBB）细胞芯片的播种和渗透性测试时间表。芯片制备（浅蓝色）和取样（深蓝色）的颜色分类，颜色根据培养体系分类。为了确认这些细胞是否附着在芯片上，我们观察了每种细胞的荧光特征。细胞播种 24 小时后，我们确认下通道中的 hBMEC（绿色）和上通道中的星形胶质细胞（红色）和周细胞（蓝色）均已均匀附着（图 2A）。为确保 BBB 芯片中两个通道之间形成紧密连接，我们在每个通道中保持稳定流动 24 小时。hBMEC 使用CD31进行了特异性染色。CD31 清晰可见于 hBMEC 的细胞间边界。顶部通道显示的是 GFAP，示踪星形胶质细胞。此外，底部通道的 hBMEC 与顶部通道的周细胞共染显示，在 hBMEC 的细胞间边界清楚地看到 CD31，在顶部通道看到 NG2 特异性染色，示踪周细胞。随后，为了验证物质在两个通道之间的限制性非选择性移动，我们用 10 μg/mL 右旋糖酐-FITC 处理了底部通道。然后，我们在不同的时间点从每个通道的出口处收集培养基并测量荧光（图 2C）。相比之下，在未处理葡聚糖-FITC 的顶部通道中，未观察到葡聚糖-FITC 的荧光，这证实了底部通道中培养的 hBMEC 形成了良好的紧密连接。此外，在对紧密连接蛋白 ZO-1 进行免疫染色时，我们证实 ZO-1 在底部通道培养的 hBMEC 膜上排列整齐（图 2D）。这些结果证实，本研究中使用的 BBB 芯片适合 BBB 渗透性测试条件，并随后用于 BBB 渗透性实验。![]()
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图 2. BBB芯片功能表征。
A：底部通道的所有表面都有 hBMECs（绿色），顶部通道的表面有 NHAs（红色，星形胶质细胞）和 HBVPs（蓝色，周细胞）。B：内皮细胞（CD31）、星形胶质细胞（GFAP）和周细胞（NG2）。C：底部通道灌注 4 kDa 右旋糖酐-FITC。D：为了证实 hBMEC 形成了血管，在底部通道鉴定了紧密连接蛋白 ZO-1（绿色）和转运体 P-gp 表达水平（红色）的免疫荧光图像。
2 利用BBB芯片评估血脑屏障渗透性效果与体内相当
通过血管屏障对药物运输至关重要。因此，我们使用BBB芯片对 10 种具有不同 BBB 渗透性的化合物进行了渗透性实验。这些药物为：咖啡因 (CAF)、卡马西平 (CBZ)、地西帕明 (DES)、洛哌丁胺 (LPM)、西替利嗪 (CET)、长春新碱 (VIN)、奈法唑酮 (NZD)、多奈哌齐 (DPZ)、辛伐他汀（SIM）和LP533401（LP）。为了分析浓度变化，我们进行了 LC-MS/MS。在 0-1、1-4、4-9 和 9-24 小时内从血液和大脑通道收集样本，并使用公式（1）计算浓度。根据时间曲线，每个通道的浓度用蓝色圆圈和红色圆点表示。用公式（2）计算出的各通道预测浓度用蓝色虚线和红色实线表示（图 3 和图 4）。CAF 作为跨 BBB 被动扩散的阳性对照，在顶端至底部通道侧药物渗透性测试中表现出很高的渗透性（图 3）。此外，作为 P 糖蛋白（P-gp）底物的 LPM 在底部通道侧对顶端药物渗透性测试中也表现出高渗透性（图 4）。![]()
图 3. BBB芯片中的药物浓度监测（从顶端到底部侧）。蓝圈（ο）和红点（●）分别代表血液通道（底部通道）和脑通道（顶部通道）中的药物浓度。各点为平均值± SD（n = 3）。虚线和实线代表根据公式 (1) 和 (2) 得出的血液和大脑中的预期浓度。
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图 4. BBB芯片中的药物浓度监测（从底部到顶部侧，与图3相反）。蓝圈（ο）和红点（●）分别代表血液通道（底部通道）和脑通道（顶部通道）中的药物浓度。各点为平均值± SD（n = 3）。虚线和实线代表根据公式 (1) 和 (2) 得出的血液和大脑中的预期浓度。
本文计算了10种药物在BBB芯片系统中的浓度（图3和图4）。我们分析了各药物在芯片中的动力学参数（表 3 和表 4）。在实验观察的周期内，大多数药物都没有达到平台期（本身观测时间也较短），但一些药物（如咖啡因、Lp533401和长春新碱）在脑通道中达到了平台期（表4）。
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K𝑝是通过两个通道的 Css 值之比计算得出的。芯片上的 BBB 与体内的 BBB 在K𝑝相当。𝑃𝑎𝑝𝑝值是利用从0h开始到计算出的平台期时的斜率计算得出的（表 4）。K𝑝值为 0.0170 和 0.4794，𝑃𝑎𝑝𝑝值为 2.1693 至 32.4598。无论BBB 渗透性水平如何，𝑃𝑎𝑝𝑝和K𝑝值的线性回归均显示出 0.608 的正相关系数，且所有化合物的值均在 95% 的置信区间内（图 5）。这表明𝑃𝑎𝑝𝑝和K𝑝值之间存在比例相关性。因此，在器官芯片中，利用将离散时间获得的数据扩展到累积数据而计算出的浓度来获得𝑃𝑎𝑝𝑝和K𝑝，是评估器官芯片渗透性的有效方法。![]()
与当前预测 BBB 通透性的方法相比，本研究中使用的BBB芯片模型有几个优点。首先，我们的模型使用人源细胞模拟人体 BBB，从而克服了物种差异。其次，它在动态可调的微环境中结合了三种细胞类型，因此比细胞培养物更好地再现了人体 BBB 的复杂性和多样性。第三，与免疫荧光染色等定性方法相比，它能通过 LC-MS/MS 对 BBB 的通透性进行定量测量，提供更可靠的数据。第四，它比动物模型更具成本效益和道德性，因为它需要的时间、空间和资源更少。
总之，我们开发了一种基于成熟的Emulate器官芯片技术的人BBB模型，用于评估药物的通透性。我们使用人源细胞模拟人体 BBB，并测量了 10 种化合物的 BBB 渗透性。我们将结果与动物和细胞培养模型的结果进行了比较，证明了我们的模型的优势和有效性。此外，我们还建立了划分系数（Kp）和表观渗透率（Papp）之间的一般相关性。我们的模型代表了预测BBB渗透性的一种新模式，可以提高药物开发的效率和安全性。
这项研究有几个局限性，需要在今后的工作中加以探究。首先，我们的模型没有包括可能影响 BBB 通透性的其他因素，如炎症、氧化应激和神经变性。这些因素可能会改变 BBB 成分（如紧密连接或转运体）的表达或功能，并影响向大脑的药物输送。其次，该模型没有考虑人体 BBB 的区域异质性，而这种异质性在病理情况下也会发生改变。例如，某些脑区的 P-gp 或其他外排转运体的表达量较高或较低，这会影响药物的敏感性。第三，它没有考虑药物与血液或大脑成分（如血浆蛋白和神经递质）之间的相互作用。这种相互作用可能会影响药物在血液或大脑中的游离部分或分布，并调节其药理作用。这些因素会影响药物在全身循环和靶组织中的生物利用度或药效。
延伸阅读：Emulate脑器官芯片-研究脑和神经生理认知反应的体外模型Emulate公司的脑器官芯片是用于临床前研究的最全面和复杂的人体神经血管体外模型，囊括了组成血管神经单元的皮质神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞、周细胞和微血管脑内皮细胞，可组成精妙的血脑屏障（BBB）。这些细胞在Emulate器官芯片仪器平台中受到精密的调控，持续进行液体流动和拉伸的生理环境模拟，可产生接近人体生理水平的基因表达、表型和功能反应。每个Emulate芯片约为 U 盘大小，包含两个由多孔膜隔开的培养通道。位于底部的流体通道由脑微血管内皮细胞形成管腔状的血管，而顶部的大脑通道则包含皮质神经元、星形胶质细胞、周细胞和小胶质细胞。基于该脑器官芯片模型，研究人员就可以研究血脑屏障的功能、药物穿过血脑屏障的能力，以及大脑生理、疾病和药物反应所涉及的复杂的细胞-细胞相互作用。![]()
图示：1 神经元; 2 小胶质细胞; 3 星形胶质细胞; 4 周细胞; 5 顶部通道; 6 多孔膜; 7 脑微血管内皮细胞; 8 底部通道.
Emulate 的脑芯片被知名机构《The Scientist》杂志评为2021 年十大创新之一。
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Reference：Yang, J.Y.; Shin, D.-S.; Jeong, M.; Kim, S.S.; Jeong, H.N.; Lee, B.H.; Hwang, K.-S.; Son, Y.; Jeong, H.-C.; Choi, C.-H.; et al. Evaluation of Drug Blood-Brain-Barrier Permeability Using a Microfluidic Chip. Pharmaceutics 2024, 16, 574. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics16050574
延伸阅读![]()
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