应用案例｜Ellison研究所应用器官芯片高内涵技术开发肿瘤迁移成像新工具

文摘科学 2024-07-02 16:58 浙江

很高兴与大家分享一篇由Ellison研究所Shannon M. Mumenthaler教授团队近期发表于<SLAS Discovery>的一篇论文，该论文通过Emulate器官芯片技术和Revvity高内涵成像技术，3D捕获结直肠癌芯片中癌细胞入血迁移的精妙过程，提供了开源的分析算法，可作为器官芯片3D结构捕获的通用方法，并有望进一步用于肿瘤机制研究和新型抗肿瘤药物疗法筛选。

研究背景

器官芯片模型是一种体外系统，旨在复制特定器官或组织的形态和功能特性。器官芯片可调控液体流动和机械拉伸，对细胞施加剪切应力，微流控通道可以设计成与相关器官的体内组织结构相匹配，相邻通道形成组织-组织界面，模拟器官动态生理环境。对于癌症等病变器官，器官芯片模型可以再现肿瘤微环境（TME）的各个方面，并促进对细胞-细胞相互作用和癌症进展的研究。因此，这些模型在癌症机制研究和药物发现应用方面具有相当大的价值。

虽然器官芯片模型为复杂的体外研究带来了令人兴奋的发展，但从器官芯片中获取成像数据的分析方法难度较大，例如芯片的三维结构、多种细胞类型共培养、模型中细胞数量少等。目前基于器官芯片的检测涉及破坏性的单时间点测量（即终点检测），经常需要对多种异源细胞类型进行批量分析。改进这些工作流程，纳入空间和细胞类型特异性信息并允许动态测量，将支持使用器官芯片进行高通量实验，并有助于药物发现研究。基于成像的检测通常能提供这种灵活性和分辨率；然而，由于设备的多变性和复杂性，器官芯片成像和分析存在挑战。这些困难存在于多种器官芯片设计中，使准确识别特定特征（如组织：组织界面）变得具有挑战性。为了解决这些问题，Ellison研究所的科学家们提出了一种全新的薄板样条插值（Thin Plate Spline, TPS）方法来示踪组织边界，并在分析器官芯片通道中量化癌细胞的动态行为。

TPS 是一种平滑样条曲线，可用于模拟坐标变换和可视化不同平滑度的模型表面。TPS 经常用于地理科学中的气候、地形和海洋制图中的表面建模。在医学领域，TPS已被应用于脑部变形的超声波图像，集成到外科手术工具中，利用立体成像数据进行器官建模，并应用于核磁共振成像数据搜索心肌变形。由于这种方法已扩展到对许多不同类型的表面或由高度可变和复杂数据代表的边界进行建模，TPS方法或许可以减轻与器官芯片成像和图像分析相关的一些挑战。

在这项研究中，Ellison研究所的科学家们开发了一种分析工作流程，应用于先前开发的结直肠癌（CRC）器官芯片系统的图像分析。该模型与共聚焦显微镜/高内涵相结合，监测CRC患者衍生类器官（PDO）癌细胞从顶部上皮通道向底部血管内皮通道的侵袭，模拟癌症转移的早期步骤。该方法考虑到了显微镜平台倾斜变化等技术伪影，同时还捕捉到了内皮组织轮廓的细节，从而能更准确地测量肿瘤细胞的行为。科学家将这种分析工作流程开发成了一种新型分析工具--芯片侵袭和轮廓分析（ChICA），用于提取器官芯片模型中的空间信息，实现更高通量的侵袭分析。

分析方法

1 基于成像的结直肠癌器官芯片细胞侵袭监测

科学家们使用了之前报道过的一种可拉伸的结直肠癌器官芯片，该芯片由顶部的上皮通道和底部的血管内皮细胞区组成，并由多孔膜隔开（由Emulate 公司生产）。简言之，将表达绿色荧光蛋白（GFP）的结直肠癌类器官种在顶部通道，将标记有红色荧光蛋白（RFP）的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）或人肠微血管内皮细胞（HIMECs）种在底部通道。六天后，使用Revvity的Operetta CLS 高内涵平台通过荧光共聚焦显微镜观察上皮细胞向内皮细胞的侵袭。具体来说，从血管内皮通道的底部到上皮细胞室的顶部（50 张切片），以5 µm的间隔对顶部和底部通道重叠的共培养区域进行成像，总 z 高度为 250 µm。利用 Revvity Harmony 软件中的三维图像分析功能，根据荧光强度对 GFP+ 肿瘤细胞和 RFP+ 内皮细胞进行分割和识别。图像分析过程各部分的总体目标以及与每个构件相关的具体参数见补充表 1。简言之，使用明场视野确定感兴趣区（芯片的重叠共培养区）。对RFP+内皮细胞进行识别、分割，并测量每个分割对象的位置属性。根据高于0 µm的中心区域选择内皮区顶层的内皮细胞群。对GFP+器官肿瘤细胞进行识别和分割，并测量每个分割对象的位置属性。作为GFP+肿瘤细胞分割的一部分，根据大小和GFP强度去除非细胞对象。导出每个对象的形态和位置信息，以便进一步分析和下游识别受侵袭的GFP+肿瘤细胞。

2 表面建模和统计分析

Harmony 图像处理的位置输出用于表面建模和统计分析工作流，将 GFP+ 对象标记为 "入侵 "或 "非入侵"。数据分析工作流程是使用 R 统计软件（v4.2.2）开发的，使用的是 fields 软件包（v15.2）中的 fastTps 函数。使用该函数，将内皮细胞边界层建模为薄板样条线。这种技术设计用于地形分析，将内皮细胞的 z 坐标近似为这些细胞的 x 和 y 坐标的函数。fastTps 函数使用一个平滑参数（lambda）（默认情况下通过广义交叉验证进行估计）和一个一阶多项式函数，其中一阶多项式函数的度数根据内皮细胞 x 和 y 坐标矩阵的维度进行选择。表面拟合采用温德兰协方差矩阵，大锥度范围（aRange）为 200，以接近标准薄板样插值。使用同一软件包中的 predictSE 函数，从 TPS 模型拟合数据的标准误差中计算出置信区间，以考虑组织的厚度，确保位于内皮层轮廓内的主动入侵上皮细胞被准确地分配到入侵状态。通过比较上皮细胞的实际 z 高度坐标和根据 TPS 生成的表面预测的 z 高度，可以进一步量化正在入侵或已经入侵的细胞数量。如果实际 z 高度低于表面高度（包括置信区间），则该细胞被视为 "入侵 "并计数。入侵 "细胞的汇总统计使用 tidyverse 软件包（v2.0.0）生成。

3 分析工具开发

本工作流程使用 R Shiny。该工具包括用户上传数据、运行分析、可视化每个芯片模型的表面和入侵细胞等选项。内含的表面绘制功能还利用字段 R 软件包中的工具创建内皮景观的近似表面（v15.2）。三维绘图工具将样条插值的坐标缩小为 100 乘 100 的矩阵，以提高绘图效率。用于构建网络工具和生成图表的代码已上传至 GitHub：https://github.com/eitm-org/chip_invasion。

1 用于结直肠癌器官芯片的高通量成像工作流程

基于器官芯片成像的侵袭工作流程主要包含以下三个方面：(1) 对多个CRC器官芯片的上皮和内皮重叠部分进行成像捕获；(2) 分析肿瘤细胞和内皮细胞的位置和形态数据；(3) 开发了一个标准的 R Shiny 工具，用于肿瘤细胞侵袭的量化和可视化（图 1）。

本研究的目的是分析Emulate结直肠癌器官芯片模型，该模型由顶部上皮通道的结直肠癌类器官和由底部血管通道的内皮细胞组成。在不同的时间点（第0天和第6天）对器官芯片进行成像，并启动循环拉伸以模拟肠道的蠕动力。使用 Revvity的Operetta CLS 高内涵分析平台，沿着共培养区域从内皮通道底部到上皮通道顶部的长度对Emulate器官芯片进行成像（50 张切片，步长为 5 微米，总 Z 高度为 250 微米），并使用 Revvity Harmony 图像分析软件进行预处理。这一过程包括识别 GFP+ 肿瘤细胞对象和 RFP+ 内皮细胞对象，并测量形态和空间信息，包括 GFP+ 和 RFP+ 对象的 x、y 和 z 位置、强度和尺寸。

这些图像显示，由于芯片在平台适配器中的对齐、器官芯片制造过程中的细微变化以及活跃的肿瘤细胞侵入对象的存在，器官芯片存在持续倾斜，而这在图像预处理中无法解释。因此，利用 Harmony 图像分析中 GFP+ PDO 和 RFP+ 内皮细胞的 x、y 和 z 位置来测量和定义通道之间的边界。这项分析的目的是根据肿瘤细胞在顶部或底部通道的存在情况，准确地将其标记为 "入侵 "或 "非入侵"。为了解决人工量化带来的问题，用 R 创建了一个标准化、可重复的工作流程。

图 1 工作流程示意图。

在多个器官芯片上播种 GFP+ 结直肠癌患者衍生的器官组织，在底部通道播种 RPF+ 内皮细胞，并在高内涵成像平台上成像。进行图像分析以提取每种细胞类型的位置和形态数据。使用芯片侵袭和轮廓分析工具（ChICA）进行数据分析，量化肿瘤细胞侵袭。

2 用薄板样条插值进行表面建模和肿瘤细胞定量

本研究中，Ellison研究所的科学家们选择薄板样条来建立内皮边界模型，这是因为薄板样条能够考虑内皮层在任何方向上的倾斜和较小尺度上的不一致性，并且能够方便地将内皮层外其他物体的相对位置与表面位置进行比较。这种方法的初步应用和可视化证实了在图像中看到的显微镜台倾斜，并发现内皮组织表面不是一个恒定的高度，而是呈现出脊和谷状轮廓。这些内皮表面的二维可视化还显示，虽然各芯片的轮廓一致，但轮廓的形状、模式和频率却不尽相同（图 2A）。接下来，将 GFP+ 对象的 x 和 y 坐标输入曲线，以确定肿瘤对象的侵袭表型。如果z-高度低于样条线和置信区间预测的z-高度，则该对象被归为 "入侵 "状态。这种方法与使用恒定的内皮平均 Z 高度或内皮层平面拟合加置信区间的简单量化方法进行了比较，人工评估发现，由于阶段倾斜和表面变化，这两种方法在芯片的某些区域会过量计算肿瘤细胞对象，而在其他区域则计算不足。这也让人担心这些方法没有捕捉到主动入侵的物体，因为图像预处理显示这些物体往往位于内皮层的轮廓内。与恒定高度法和平面法相比，地形法能捕捉到内皮组织轮廓内的主动入侵细胞，而不受倾斜或其他表面不一致的影响（图 2B）。

一旦捕捉活跃的入侵细胞，该方法就被功能化为可重复的分析流程，以读取多个芯片的成像结果，建立内皮表面模型，并量化入侵的肿瘤细胞，将该方法定义为芯片侵袭和轮廓分析（ChICA）工具，以确保可重复性，允许同时对多个（6-12 个）芯片进行更高通量的分析。利用 ChICA，可视化入侵对象的 x-y 和 x-z 位置，以进行质量控制。例如，在一个有轻微制造不规则的器官芯片中，顶部和底部通道没有完全重叠，可视化结果显示在没有内皮细胞存在的器官芯片边缘有肿瘤细胞侵袭（图 2C）。用户可以进一步完善图像分析管道，排除这些区域，以准确评估存在内皮细胞的肿瘤细胞侵袭情况。质量控制评估完成后，实验人员可以使用随附的模板上传入侵上皮对象和边界内皮对象的位置输出。位置数据可以来自任何图像分析工作流程，任何数据预处理或清理工作都应在这一步完成。上传后，用户就可以生成组织的表面模型，量化受侵物体的数量，并以二维和三维方式观察内皮表面和受侵物体。ChICA 工具的访问网址为 https://chica.eit.org/。

图 2 建立内皮表面模型可增强高通量器官芯片实验的数据读取。

(A）将地形表面法应用于播种有 HUVECs 并在第 0 天成像的器官芯片。通过对内皮位置数据进行薄板样条拟合生成表面，并以二维形式显示，x 轴和 y 轴显示 x 和 y 位置，z 轴高度使用渐变色标显示。表面显示波浪状轮廓，z 高度从高 x 位置逐渐下降到低 x 位置。(B) 将 A 中的地形表面法与量化肿瘤侵袭的更简单方法进行比较。在恒定高度法（左）中，低于内皮细胞中心点的平均 z 高度加上置信区间的物体被标记为入侵。平面法（中）将低于与内皮中心点拟合的平面加上其置信区间的物体标记为入侵。地形法（右图）将低于内皮表面及其置信区间的物体标记为入侵物体。在每幅图中，用简单方法和地形方法标记为入侵的物体均以蓝色表示。简易方法和地形方法在侵袭状态上存在分歧的物体用橙色表示。(C) 地形表面工作流程内置于一个无需计算背景即可使用的公开网络工具中。该工具的用户界面（左）提供了上传数据和以表格或图表形式显示结果的选项。该工具还包括按 x 和 y 位置（右上方）以及 x 和 z 位置（右下方）绘制肿瘤细胞受侵对象图的选项，以便进行质量控制。这些图捕捉到了图像分析质量控制中遗漏的器官芯片模型边缘的受侵对象，并用箭头表示。

3 芯片上动态监测肿瘤侵袭

Ellison研究所的科学家们将该新工具应用于不同内皮细胞类型的结直肠癌芯片中，并监测了肿瘤细胞的侵袭动态。由于 HUVECs（一种来源于脐带的内皮细胞类型）在生物学研究中的广泛应用，最初使用 HUVECs 搭建结直肠癌器官芯片中的血管通道。为了更好地再现结肠生理学，使用了结肠特异性HIMECs的进行模型搭建。ChICA的应用揭示了第6天内皮表面轮廓的质量差异。HUVEC的轮廓更加规则，呈现出一致的波浪形状。另一方面，HIMECs 芯片之间的差异更大，有些芯片表面更平坦，波浪形更明显，或整个表面凹陷或弯曲（图 3A）。如图 3B 所示，尽管两种内皮细胞类型所形成的表面存在差异，ChICA 工具仍能创建表面边界。该工具还显示，除了内皮表层的质量差异外，内皮细胞类型还导致第6天底部通道中被侵袭的肿瘤细胞数量不同，与 HIMECs 相比，在播种了 HUVECs 的芯片中观察到更多的侵袭（图 3B）。此外，通过对第 0 天和第 6 天的相同芯片进行成像，量化了六天实验过程中肿瘤细胞的侵袭情况。无论内皮细胞类型如何，随着时间的推移，侵袭都在增加（图 3C）。通过 ChICA 工具，可以发现 HUVECs 和 HIMECs 之间的生物学差异及其对侵袭行为的影响。

图 3 标记和量化侵袭细胞。

(A) 分析不同内皮细胞的器官芯片模型，并以二维形式显示，x 轴和 y 轴上显示 x 和 y 的位置，z 轴高度使用渐变色标显示。不同内皮细胞形成的表面显示出不同的轮廓模式。HUVEC 内皮细胞表面（左）显示出整个表面高度相似的规则波浪状轮廓。HIMEC 内皮细胞表面（右图）显示出不规则的轮廓，偶尔有内皮物体位于中心表面的上方或下方。(B) 由 HUVECs（左）或 HIMECs（右）形成的内皮表面的三维重建，显示用于标记肿瘤细胞入侵或非入侵对象的边界。肿瘤细胞被标记为蓝色。 (C) 使用 ChICA 工具测量的侵袭的 GFP+ 肿瘤细胞数量。在实验的第 0 天和第 6 天，对内皮细胞区中含有 HUVECs（左）或 HIMECs（右）的结直肠癌器官芯片进行成像，并根据细胞与内皮细胞表面的相对位置识别入侵细胞。

4 小结

Ellison研究所的科学家们开发了一种新型成像分析工具（ChICA），基于数学表面建模技术实施标准化分析工作流程，以量化结直肠癌器官芯片模型中的肿瘤细胞侵袭。这种方法考虑了技术伪影，减少了人工操作，从而提高了通量和研究质量。虽然成像领域在改进显微镜及其相关图像分析软件方面取得了长足进步，但这些工具往往将分析简化为二维表示，从而可能错过系统的空间特征。一些开源图像分析工具提供三维分析选项，但这些工具通常需要计算方面的专业知识，并依赖于多个手动过滤步骤，从而限制了自动分析和执行高通量研究的能力。ChICA 工具可通过标准工作流程一次处理多个芯片，从而消除了人工偏差，提高了研究人员从成像数据中提取有意义信息的速度。此外，该工具还能让用户研究TME内细胞的三维空间动态，包括研究主动入侵的肿瘤细胞--其他方法可能会遗漏这一关键群体。这种方法提供了准确的空间信息，可用于阐明内皮区室中入侵细胞的位置（即内皮区室的顶层或底层）、异常对象的存在，并捕捉内皮中可能与不同细胞类型（如 HUVECs 与 HIMECs）相关的、具有生物学或药理学意义的表型差异。

将内皮屏障表示为轮廓表面，而不是恒定高度边界或平面的方法，具有广泛的适用性。本工作流程的使用范围可扩展到细胞在隔室间移动的其他细胞类型或疾病，如监测癌症或炎症性肠炎等不同病变器官中免疫细胞的迁移、内渗或外渗。其他器官芯片模型，包括有绒毛或其他空间变化较大的边界组织的模型，都可以从高保真三维重建和相应的数据分析工作流程中获益。此外，当使用和标记多种不同类型的细胞时，ChICA 工具还可用于量化细胞迁移和存活率读数。

与更简单的模型相比，使用Emulate器官芯片的主要优势在于保留了体内细胞类型和空间组织的变化和异质性。分析工作流程应考虑到这种变化，而不是降低和掩盖系统的维度。ChICA 是数据分析工作流程的典范，它不仅考虑到了模型的维度，而且还利用了模型的优势。通过承认器官芯片模型的空间动态性，药物发现研究可以更有效地再现生物系统如何对扰动做出反应，从而使这些研究更具参考价值。

Reference：Elton, Elizabeth et al. “A novel thin plate spline methodology to model tissue surfaces and quantify tumor cell invasion in organ-on-chip models.” SLAS discovery : advancing life sciences R & D vol. 29,4 (2024): 100163. doi:10.1016/j.slasd.2024.100163