Cell Reports 案例| 单细胞测序技术揭示iPSC肠道芯片的细胞类群和分化轨迹

为了对 EM、DM 和 EM-DM 条件下芯片上 hiPSC 衍生肠道的细胞多样性进行非靶向的高分辨率表征，科学家们在第6天对从芯片中分离出来的细胞进行了scRNA-seq 分析。与显微镜和流式细胞术数据一致，科学家们发现了两个转录不同的细胞区：一个与肠上皮细胞（EPCAM-、CDX2-和 CDH1 阳性）相对应，另一个是 EPCAM 阴性和 VIM 阳性的细胞区（图3A和3B）。后者包括间充质细胞和神经细胞的特征标记，因此科学家们将其命名为间充质/神经区室。在上皮细胞区系中，科学家们根据差异表达基因与经典标记的一致性确定了五种主要的上皮细胞亚型：转运扩增（TA）/干细胞（SMOC2、LGR5、MKI67、TOP2A、PCNA 和 CENPF）、肠细胞（1 型：FABP2、RBP2、APOA4、CYP3A5、ALDOB、ANPEP、SI 和 SLC2A2；2 型：SLC39A4、MT1E、MT1G、MT1H 和 MT2A；祖细胞：FGB 和 FGG FGB和FGG）、Paneth样细胞（LYZ和PRSS2）、鹅口疮细胞（MUC2、TFF3、ZG16和CLCA1）和肠内分泌细胞（CHGA、NEUROD1、MLN、GHRL和GCG）（图3A和3B）。1 型和 2 型肠道细胞都表达参与脂质、肽、碳水化合物、维生素和药物代谢和吸收的典型肠道细胞标记物，但2型肠道细胞还表达金属硫蛋白和金属转运体（如锌转运体 SLC39A4），表明其在矿物质代谢中发挥作用（图 3B）。类盘尼西林细胞表达两个盘尼西林特征基因（LYZ 和 PRSS2），并富集了抗微生物肱骨反应途径，但它们不表达防御素基因，因此被称为类盘尼西林细胞（图3B）。两个上皮细胞群同时表达EPCAM和VIM，因此被命名为间充质样上皮细胞 1 型和2型（图3B）。第三个上皮细胞群只有部分VIM阳性，被命名为间充质样上皮前体细胞（图3B）。尤其是间充质样上皮细胞2型群，其次是前体细胞群，与间充质/神经室共享许多富集通路。为了简化进一步的分析，科学家们将肠细胞1型和2型以及肠细胞祖细胞归类为肠细胞，将间充质样上皮细胞1型和2型以及前体细胞归类为间充质样上皮细胞。

在间充质/神经区划中，科学家们发现了四个表达肠间充质和肠神经系统特征标记物的集群：分裂的间质/神经细胞（MKI67、TOP2A、PCNA和CENPF）、肌成纤维细胞（COL1A1、COL1A2、DCN、TAGLN、ACTA2、ACTG2和MYL9）、神经元（ELAVL3、 ELAVL4、GAP43、CRABP1、ONECUT2、STMN2和TUBB2B）和 WNT4 阳性神经细胞（NCAM1、NTN1、SLIT2、NTRK2 和 WNT4）（图 3A和3B）。肌成纤维细胞表达与胶原生成相关的成纤维细胞特征基因、平滑肌相关肌动蛋白基因和肌球蛋白基因 MYL9，但缺乏平滑肌特征基因 DES 和 MYH11 的表达（图 3B）。WNT4 阳性的神经细胞富含轴突导向相关基因，并表达与神经胶质细胞功能相关的 WNT4，但神经胶质细胞特征标志物（S100B、SOX10 和 PLP1）没有表达（图 3B）。然而，在科学家们的片上肠道系统中，神经元在不同的生物重复和所有培养基条件下都得到了一致的发育。

上皮细胞和间充质/神经细胞之间的比例以及亚型组成在不同生物重复之间具有可重复性，但在不同培养基条件下却有很大差异（图3C）。总体而言，与 EM-DM 条件（9.3% ± 4.9%）和 DM 条件（3.5% ± 1.1%）相比，EM 条件下间质/神经细胞的比例最大（38.7% ± 10%）（图 3C）。在EM条件下，上皮细胞和间质/神经细胞都含有很大比例的分裂细胞（上皮细胞：42.5% ± 4.4%，间质/神经细胞：85.2% ± 0.7%）（图3C）。在 EM-DM 和 DM 条件下，分裂细胞的频率降低（上皮细胞：分别为 16.3% ± 5.8%、11.2% ± 2%；间充质/神经细胞：分别为 59.6% ± 7.9%、31.6% ± 10.1%），这与这些条件下组织高度和细胞密度的降低相一致。EM-DM和DM条件下分裂细胞的减少主要与上皮细胞中肠细胞、鹅口疮细胞和肠内分泌细胞频率的增加以及间质/神经细胞中肌成纤维细胞、神经元和WNT4阳性神经细胞频率的增加相对应（图3C）。这些观察结果表明，暴露于 EM-DM 条件下的片上肠道捕获并平衡了分裂、祖细胞和成熟上皮细胞阶段以及分裂的间质/神经细胞、肌成纤维细胞和神经细胞群。

为了研究芯片上的 hiPSC 衍生肠是否是人类小肠的代表模型，科学家们将数据集与人类肠组织的 scRNA-seq 数据进行了比较。科学家们利用人类胎儿内胚层图谱证实，相对于其他来自内胚层的器官，芯片上的 hiPSC 衍生肠道具有整体肠道表型。利用肠道细胞图谱（Gut Cell Atlas）的参考数据集科学家们预测了芯片上肠道细胞的年龄、肠道区域和细胞类型特征（图 4A-4C）。据预测，芯片肠道系统中的大多数细胞类似于人类肠道发育早期的胎儿阶段，相当于人类妊娠的前三个月（图 4A）。只有最成熟的肠细胞和类 Paneth 细胞分别被预测为第二孕期和成年期的细胞。在 EM-DM 和 DM 条件下，大多数细胞的肠区域被投射为小肠，而在 EM 条件下，二分之一的细胞被投射为大肠（图 4B）。

通过将芯片上的肠道细胞投射到人类肠道细胞簇上，科学家们的细胞类型簇分配得到了验证，但存在一些明显的差异。Paneth样细胞群部分被预测为Paneth细胞，但也被预测为微折细胞和胎儿近端祖细胞；分裂的间质/神经细胞被预测为神经细胞（主要是循环肠神经嵴细胞/胶质细胞）而不是间质细胞；WNT4阳性神经细胞主要被预测为肠神经嵴细胞/胶质细胞祖细胞（图4C和S6B）。这些结果得到了相关性分析的验证，该分析表明芯片上的肠细胞类型与人类小肠中的相应细胞类型高度相关，但 Paneth 样细胞除外，它们与特定的上皮亚型没有很强的相关性（图 4D）。此外，利用参考数据验证细胞类型特性还能让科学家们更深入地了解芯片肠道系统中预测的肠内分泌细胞亚型。在 EM-DM 和 DM 条件下，发现了类似 M/X、I、肠石蜡细胞和 D 细胞的细胞（图 4E）。肠芯片中肠内分泌细胞群的 scRNA-seq 数据证实了与这些细胞和其他几种亚型（L、N 和 S 细胞）相对应的激素表达（图 S6C）。

最后，科学家们将芯片上肠道的细胞类型比例与肠道细胞图谱数据集描述的人类小肠细胞类型比例进行了比较。在 EM 条件下，上皮细胞与间质细胞/神经细胞的比例以及分裂的上皮细胞比例与人类胎儿小肠的组成最为相似，而在 EM-DM 和 DM 条件下，上皮细胞与间质细胞/神经细胞的比例以及分裂的上皮细胞比例则向人类成人小肠的组成转变（图 4F 和 4G）。此外，上皮亚型的组成也向类似于人类成人小肠的方向转变，在三种培养基条件中，EM-DM 条件下的上皮亚型组成最接近人类成人小肠（图 4H）。利用不同培养基条件下的差异表达基因进行的相关分析强调了DM诱导的芯片上肠道细胞向后期发育状态的成熟（图4I）。

总体而言，与人类肠道相比，预测芯片上的肠道在 EM、EM-DM 和 DM 条件下具有小肠和胎儿表型。不过，科学家们可以通过暴露于 EM-DM 条件下诱导系统成熟，并将其引导至类似于成人人类肠道的细胞类型组成。

图4 肠道器官芯片与人体肠道的比较。

(A-C）基于人类肠道数据（肠道细胞图谱数据27,32，包括 STAR 方法中讨论的所有年龄组、区域和分区）的 UMAP 预测和预测年龄组（A）、肠道区域（B）和细胞类型（C）的比例。图中显示了大于 10 个细胞的预测细胞类型。(D) 片上肠道与人类小肠（肠道细胞图谱数据，包括所有年龄组）细胞类型之间的相关性分析。根据芯片上肠道细胞类型之间差异表达基因（DEGs）的平均表达量得出相关性评分。颜色强度和点的大小与皮尔逊相关性得分相对应，不显著的相关性（p > 0.01）留空。(E）根据（A-C）所述人类肠道数据预测的芯片肠道内分泌细胞类型比例。(F-H）芯片肠道和人类小肠（肠道细胞图谱数据）中上皮细胞、间充质细胞和神经细胞（F）、分裂和非分裂上皮细胞（G）以及上皮亚型（H）的比例。(I）芯片肠道和人类小肠（肠道细胞图谱数据，包括上皮细胞、间充质细胞和神经细胞）培养基条件之间的相关性分析。相关性评分是根据芯片肠道培养基条件之间 DEGs 的平均表达量计算得出的。颜色强度、点大小和其他条件同 (D)。

肠上皮的分化是沿着隐窝-绒毛轴从干细胞和TA细胞向成熟的吸收细胞和分泌细胞类型发展的。科学家们进行了轨迹和时间分析，以研究肠芯片中肠上皮细胞系的分化模式是否与人类肠道中描述的模式相似。将所有三种培养基条件的数据集结合起来，利用 RNA 速度推断片上肠数据的总体方向性。对于上皮细胞和间质/神经细胞群，分化轨迹和伪时间分析表明了从分裂细胞（分别为TA/干细胞和分裂的间质/神经细胞）到成熟细胞类型的方向性（图5A和5B）。有趣的是，预测神经元和肌成纤维细胞群是从分裂的间充质/神经细胞的同一群体中产生的（图 5A）。为了进一步研究品系诱导的机制，科学家们鉴定了参与肠细胞（1 型和 2 型）、Paneth 样细胞、肠内分泌细胞、肌成纤维细胞和神经元命运分化的推定驱动基因（图 5C）。图 5C中突出显示了先前描述的上皮细胞系驱动基因，这些基因在肠内分泌细胞系中尤为普遍（即：NEUROG3、PAX4、PAX5、PAX6、PAX7）。总之，这些数据让科学家们深入了解了芯片肠中hiPSC衍生肠系的分化轨迹，并表明与人类或小鼠成体干细胞衍生肠组织的分化轨迹相似。

最后，科学家们将芯片上肠道的细胞类型比例与肠道细胞图谱数据集描述的人类小肠细胞类型比例进行了比较。在 EM 条件下，上皮细胞与间质细胞/神经细胞的比例以及分裂的上皮细胞比例与人类胎儿小肠的组成最为相似，而在 EM-DM 和 DM 条件下，上皮细胞与间质细胞/神经细胞的比例以及分裂的上皮细胞比例则向人类成人小肠的组成转变（图 4F 和 4G）。此外，上皮亚型的组成也向类似于人类成人小肠的方向转变，在三种培养基条件中，EM-DM 条件下的上皮亚型组成最接近人类成人小肠（图 4H）。利用不同培养基条件下的差异表达基因进行的相关分析强调了DM诱导的芯片上肠道细胞向后期发育状态的成熟（图4I）。

总体而言，与人类肠道相比，预测芯片上的肠道在 EM、EM-DM 和 DM 条件下具有小肠和胎儿表型。不过，科学家们可以通过暴露于 EM-DM 条件下诱导系统成熟，并将其引导至类似于成人人类肠道的细胞类型组成。

图 5 分化轨迹和细胞间通讯的特征。

(A)通过基于分区的图抽象分析，结合 RNA 速度推导的方向性，推算出肠芯片中细胞类型的分化轨迹。(B) 由 RNA 速度分析得出的潜伏时间预测。(C) 沿着特定轨迹的顶级推定驱动基因的时间激活。之前在成体干细胞衍生的肠组织中报道的驱动基因用箭头标记。(D）有助于向间充质样上皮细胞 2 型群分化的命运概率。(E）沿着间质样上皮细胞 2 型的轨迹，最高推定驱动基因的时间激活。与 EMT 相关的基因用箭头标记。(F) 特征性肠上皮标志物（EPCAM、CDX2 和交界标志物：CDH1、CLDN4 和 CLDN7）和间充质标志物 VIM 的平均基因表达。(G) 染色标记物 CDX2 和 VIM 的具有代表性的免疫荧光共聚焦图像。(H）流式细胞术测定的 EPCAM 和 VIM 蛋白表达。(I) 细胞类型之间潜在的细胞-细胞相互作用比例，按信号通路分组。在所有培养基条件下，占相互作用次数（n）>2%的途径被归为其他途径。(J) 在培养基条件的综合数据集中，BMP 和 WNT 通路的潜在细胞间相互作用的频率。图中显示了每种途径检测到的配体。

在肠芯片的上皮细胞区，科学家们发现了几个细胞群（间充质样上皮前体和细胞 1 型和 2 型），它们同时具有上皮细胞和间充质细胞的特征，因为它们表达 EPCAM 和 VIM 和/或富集了与间充质/神经细胞区共享的通路（图 3B）。科学家们通过预测片上肠道中哪些细胞可能有助于某种分化系，并据此推断细胞命运，从而研究这些细胞集群是否表明上皮向间充质转化（EMT）。这些命运概率结合轨迹分析预测，一些上皮亚型，尤其是间质样上皮前体和1型细胞，有更大的概率向间质样上皮细胞2型集群分化（图5D），向该集群分化包括许多与EMT相关的假定驱动基因，包括claudins、cadherins和cytokeratins（图5E中箭头所示）。42 与其他上皮细胞集群相比，2 型集群中这些上皮特征性连接基因中的几个基因表达量减少，表明与 EMT 相关的极性丧失（图 5F）。流式细胞术和显微镜在蛋白质水平上验证了表达 VIM 的上皮细胞的存在，表明与 EM-DM 和 DM 条件相比，EM 条件下表达 VIM 的 EPCAM 或 CDX2 阳性细胞的丰度较高（图 5G 和 5H）。这些观察结果与在 EM 条件下观察到的高比例间质样上皮细胞相一致（图 3C）。不仅间质样上皮细胞集群显示出 EMT 特征：与 EM-DM 和 DM 条件相比，同一组 EMT 相关基因（VIM、COL4A2、COL18A1、SPARC、LAMA1、LAMB1 和 VCAN）在 EM 条件下的 TA/干细胞、肠细胞和 Paneth 样细胞中表达不同（图 3D）。43 因此，在 EM 条件下，与 ECM 组织相关的通路在 TA 干细胞和类 Paneth 细胞集群中富集（图 3D）。这些数据共同表明，主要在 EM 条件下，上皮亚型向 EPCAM 和 VIM 阳性状态过渡，然后向成纤维细胞样表型过渡。在胚胎发育过程中，EMT 是一个重要而丰富的过程，这表明 EM 条件可能更类似于胚胎生长环境，强调了 hiPSC 衍生组织的胎儿特征。

肠上皮细胞命运分化需要 WNT 和 BMP 通路的局部激活和抑制，而来自微环境（特别是底层间质区）的信号会促进这种分化。科学家们通过研究配体-受体对的表达来研究肠芯片中上皮细胞、间质细胞和神经亚型细胞之间的潜在相互作用，从而调查细胞-细胞间的交流。BMP 和 WNT 通路是肠芯片中显示出最多潜在相互作用的通路之一（图 5I）。据预测，肌成纤维细胞和 WNT4 阳性神经细胞群是 BMP 和 WNT 配体最有效的发送者，这些配体包括 BMP2 和 BMP4（人类肠道中的主要 BMP1）以及 WNT2B、WNT3、WNT5A 和 R-spondin 3，后者是 WNT 信号转导的增效剂，在 EM-DM 和 DM 条件下只能作为配体被检测到（图 5J）。在片上肠道中，EM 条件下补充 Noggin 可抑制 BMP 通路，而 DM 条件下则不然，两种培养基中均未加入外部 BMP 配体。这表明在 EM-DM 和 DM 条件下，内在分泌的 BMP 配体可能会产生影响。在 EM 中，CHIR99021 的加入激活了 WNT 通路，这可能会使细胞衍生的 WNT 配体变得多余，但 DM 中没有加入外部 WNT 配体，可能会有利于内在诱导的 WNT 信号转导。最后，许多配体与受体的相互作用是通过肠芯片中的 ECM 成分（如胶原蛋白和层粘连蛋白）预测的（图 5I ）。ECM 与细胞的相互作用在人类肠道的组织重塑、组织和细胞分化过程中至关重要44 ，可能有助于芯片上肠道细胞的自组织。同样，ephrin和semaphorin通路在片上肠道中也包含许多相互作用，它们被描述为参与组织和细胞引导（图5I）。然而，这些潜在的相互作用在片上肠道中的相关性仍有待研究，因为这些通路中有几种也会通过培养基中的因子被激活或抑制。

为了测试芯片肠道对环境因素的生物反应性，科学家们将该系统暴露于Ⅰ型和Ⅱ型干扰素（IFNs），这些促炎细胞因子与多种肠道疾病（如 CeD 和 IBD）有关。科学家们证实，无论将 IFN-β（500 U/mL）或 IFN-γ（100 ng/mL）引入顶部和底部通道，还是同时引入这两个通道，顶部和底部通道的细胞都有反应，只是程度不同。因此，为了模拟人类肠道固有层的炎症状态，在 EM-DM 条件下，将 IFN-β 或 IFN-γ 加入肠芯片的底部通道 6 小时，并进行 scRNA-seq 分析。暴露于两种类型的 IFNs50 后，既定的 IFN 诱导基因和通路均上调（图 6A ）。然后将芯片肠道中 IFN 诱导的基因与公开研究中 CeD51 或 IBD52 患者肠道活检组织中表达不同的基因进行比较，以评估反应的生理相关性。科学家们观察到，153 个 IFN-γ 诱导的基因中有 93 个与疾病相关基因重叠，78 个 IFN-β 诱导的基因中有 43 个与疾病相关基因重叠，导致了显著的富集，这表明疾病相关的 IFN 通路可以在芯片上的肠道中重现（图 6B）。

图 6 上皮细胞、间充质细胞和神经细胞对 IFN-β 和 IFN-γ 的选择性细胞反应

(A) EM-DM与IFN-β刺激或IFN-γ刺激条件下最高差异表达基因（DEGs）的平均表达量。使用 Reactome 数据库对所有 DEGs 进行通路富集分析。(B) IFN-刺激的芯片肠道和 CeD51 及 IBD52 人肠道活检组织中 DEGs 的重叠，分别与未受刺激的芯片肠道和对照组活检组织进行比较。芯片肠道中 IFN 诱导的 DEGs 明显富集于疾病相关的 DEGs，调整后 p = 4.4e-16（IFN-β），p = 4.4e-16（IFN-γ）（R 中的界限）。(C) 在 EM-DM、IFN-β 刺激和 IFN-γ 刺激条件下，IFN-β 和 IFN-γ 反应细胞的 UMAP 投影。(D) IFN-β 或 IFN-γ 刺激后 IFN 反应上皮细胞和间质/神经细胞的比例。(E和F）IFN应答细胞和非应答细胞中上皮细胞、间充质细胞和神经细胞亚型（E）和细胞周期阶段（F）的比例。

有趣的是，尽管IFN-β和IFN-γ受体在上皮细胞、间质细胞和神经亚型中均有表达，但芯片肠道中的部分细胞而非所有细胞都对IFN-β和IFN-γ有反应（图6C）。引人注目的是，只有 10.3% ± 0.02% 的上皮细胞对 IFN-β 有反应，30.6% ± 0.05% 的上皮细胞对 IFN-γ 有反应，而 68.2% ± 0.09% 的间质/神经细胞对 IFN-β 有反应，66.8% ± 0.03% 的间质/神经细胞对 IFN-γ 有反应（图 6D）。上皮细胞和间充质/神经细胞对 IFN 敏感性的差异可能是由于间充质和神经细胞在肠芯片的底部通道直接接触细胞因子（图 2A）。科学家们发现在 IFN 反应的上皮细胞中富集了 TA/干细胞和肠细胞祖细胞，而在 IFN 反应的间充质/神经细胞中富集了分裂的间充质/神经细胞和肌成纤维细胞（图 6E）。这与IFN-β和IFN-γ应答细胞中分裂细胞（如处于细胞周期S期和G2/M期的细胞）的比例高于非应答细胞的观察结果一致（图6F）。事实上，I型IFN反应依赖于细胞周期状态，这可能解释了在相对较短的6小时刺激期内对IFNs的选择性反应。

源自 hiPSC 的肠道芯片可用于模拟细胞对外部因素（如细胞因子）的选择性反应。研究表明，分裂的上皮细胞、间充质细胞和神经亚型对 IFN-β 和 IFN-γ 刺激的反应比不分裂的细胞更强，这表明芯片肠道中不同细胞对 IFN 的敏感性存在差异。

人类诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的肠道器官组织是研究发育生物学和个性化疗法的宝贵工具，但其封闭的拓扑结构和相对不成熟的状态限制了其应用。本研究中，科学家们利用Emulate器官芯片技术，在一个更符合生理的体外微环境中开发出了一个具有顶端和基底侧通道的 肠道屏障模型。为了沿隐窝-绒毛轴复制生长因子梯度，科学家们将细胞局部暴露于扩增和分化培养基中。在这些条件下，肠上皮细胞自我组织成具有生理屏障完整性的绒毛状褶皱，肌成纤维细胞和神经元出现并在底部通道形成上皮下组织。生长因子梯度有效地平衡了分裂细胞和成熟细胞类型，诱导了肠上皮细胞的组成，包括吸收系和分泌系，与人类小肠的组成相似。这种特性良好的 hiPSC 衍生肠芯片系统有助于对人类小肠的生理过程和治疗发展进行个性化研究。