默沙东案例1｜头对头比较显示Emulate肠道芯片预测口服多肽药物性能优越

文摘科学 2024-07-09 16:59 浙江

很高兴与大家分享一篇一周前由默沙东John P. Gleeson博士和 Stephanie Y. Zhang博士团队近期发表于<Molecular Pharmaceutics>的一篇论文，该论文通过头对头比较Emulate肠道芯片技术和传统静态Transwell培养技术，解析了肠道芯片的屏障功能基线标准，并测试了两款口服多肽渗透促进剂的有效浓度，揭示了Emulate肠道芯片更具备人体生理相关度，其结果与临床观测数据接近，可作为评估口服多肽药物渗透性的平台工具，填补传统模型和体内模型的技术空白。

研究背景

多肽类药物的口服给药是给药领域的一项关键挑战，肠道渗透促进剂（PE）通过调节肠道上皮细胞的屏障功能解决口服药物生物利用度低的问题。肠上皮的先天屏障功能阻止了多肽药物的口服吸收，因为细胞旁途径受紧密连接调节，只允许小于500Da的亲水性分子在细胞间通过。肠道渗透促进剂（PE）通常通过扰动紧密连接蛋白发挥作用，从而向较大的分子开放细胞旁空间。PE是已上市药物MYCAPSSA（口服奥曲肽）和RYBELSUS（口服司马鲁肽）配方的重要组成部分，并且已进入口服PCSK9抑制剂多肽药物的后期临床试验阶段。将更多口服多肽药物推向临床的一个限制因素是缺乏可预测的体外模型。

在进行体内研究之前，用于评估PE疗效的典型模型有Caco-2细胞系、HT-29细胞系、啮齿动物肠道组织以及常温/非常温肠囊。Caco-2被认为是肠道细胞系的金标准，普遍用于估算屏障功能的表观渗透系数（Papp），但往往显示出比体内观察到的更高的肠道渗透效率，使得评估差距过大。因此，有必要开发更优越的模型，如复杂体外模型（CIVM），以更恰当地预测PE的疗效，并使制剂开发能更成功地应用于临床。CIVM广义上可定义为3D微组织（类器官球）、三维生物打印组织和/或微流控系统。目前Emulate已开发出包括双向流动和生物力学拉伸等胃肠道环境关键特征的肠道芯片模型。在这些芯片中加入了各种细胞来源，包括Caco-2、iPSC衍生的肠道类器官、活检衍生的肠道类器官等。

在本研究中，默沙东的科学家们介绍了Emulate肠道器官芯片的使用方法，并将其与静态Transwell模型进行了头对头比较。选择了两种中链脂肪酸（MCFA）肠道渗透促进剂（PEs）：癸二酸钠（NaCap）和蔗糖单月桂酸酯（Sucrosemonolaurate），这两种肠道渗透促进剂（PEs）在体内和体外模型中都具有公认的功效。默沙东的科学家们假设，在Emulate肠道芯片中培养的Caco-2细胞的三维形态将再现原生肠道，并能更好地预测肠道渗透促进剂（PES）在临床开发中的疗效。本研究确定了Papp的时间历程、适当的缓冲系统和肠道渗透促进剂（PES）的工作浓度，以便在模型之间进行直接比较。本文提供的数据表明，与Transwell模型相比，Emulate肠道芯片模型需要更高浓度的肠道渗透促进剂（PES）才能引起右旋糖酐、胰岛素和奥曲肽等大分子渗透性的适度增加。这使Emulate肠道芯片在预测性方面更接近体内模型，同时保留了体外模型的可控性。

1 建立Caco-2肠道芯片的屏障完整性基础参数标准

在Transwells上单层培养的Caco-2细胞需要21天的培养时间才能充分极化细胞并形成完整的屏障。为了建立Transwell和Emulate肠道芯片的比较基础，默沙东的科学家们首先测定了在Emulate肠道芯片中培养的Caco-2细胞的基础表观通透性（Papp），并在培养期间在顶部通道的培养基DMEM中添加了3kDa的Cascade Blue-Dextran（卡斯卡德蓝-葡聚糖）（图1A）。默沙东的科学家们对连续培养2周的四批Caco-2芯片（n=12）的Papp时间过程进行了跟踪。结果表明，屏障完整性从培养后7天开始建立，基础Papp为2.1±2.3×10-7cm/s。接下来，默沙东的科学家们使用缓冲液（HBSS，添加葡萄糖和HEPES）和FITC-Dextran 3kDa（FD3）作为细胞旁标记物，将黄金标准的Transwell通透性测定法应用于Emulate肠道芯片系统。基础FD3的Papp用作质量控制，以取代在芯片系统中无法进行的跨上皮电阻（TEER）测量。第7天测量的7批Caco-2芯片（每批12个）的FD3 Papp为3.2±1.8×10-7cm/s（图1B）。本研究各组的纳入标准为平均值+(SD×2) Papp<7×10-7cm/s。

图1. Emulate肠道芯片的屏障完整性和基础渗透性。

(A)Cascade Blue-Dextran 3kDa在细胞培养基中的时间依赖渗透性。(B)多批培养的Caco-2芯片在第7天测量的FITC-Dextran 3kDa在含葡萄糖和HEPES的HBSS缓冲液中的渗透性。数据为平均值±SD，n=最少6个。

2 两种渗透促进剂在Transwell和肠道芯片中的头对头比较

Caco-2单层细胞的基础TEER为994±130Ω-cm2，基础Papp为5.3±0.8×10-8 cm/s（图2A）。在顶部通道中添加癸二酸钠（NaCap）导致Papp以浓度依赖性方式增加。同样，单月桂酸蔗糖也会导致Papp上升。Papp的增加反映在NaCap（图2B）和单月桂酸蔗糖（图2C）的TEER随浓度的降低而降低。根据本研究的结果和之前文献报道，本研究确定10mM癸二酸钠（NaCap）和1mM单月桂酸蔗糖为Transwell试验的有效浓度。

图2.生长在Transwells上的Caco-2细胞对渗透促进剂癸二酸钠（粉红色）和单月桂酸蔗糖（绿色）的渗透性呈浓度依赖性增加。 (A)FD3在存在或不存在渗透促进剂的情况下的Papp。加入肠道渗透促进剂（PES）后，(B) 癸二酸钠和(C)单月桂酸蔗糖的TEER会随着浓度的变化而降低。

接下来，默沙东的科学家们在Emulate肠道芯片模型中研究了这些肠道渗透促进剂（PES）对FD3渗透性的影响。在125μL/h的流速下，基础Papp为2.9±1.6×10-7 cm/s。选择125μL/h的流速作为基线流速的依据是文献和测量时需要足够的流出物。从Transwells中添加有效浓度的癸二酸钠和单月桂酸蔗糖对FD3 Papp的影响极小：分别为3.4±0.9×10-7cm/s和5.4±0.7×10-7cm/s（图3A）。增加肠道渗透促进剂（PES）浓度会导致癸二酸钠（25mM[8.8±4.6×10-7cm/s] <50mM[57.6±4.7×10-7cm/s]）和单月桂酸蔗糖（10mM[9.2±2.1×10-7 cm/s]<20mM[155.4±35.6×10-7 cm/s]）的Papp增加。本研究确定25mM癸二酸钠和10mM单月桂酸蔗糖是芯片检测的有效肠道渗透促进剂（PES）浓度。

利用这些浓度，默沙东的科学家们研究了流速的影响。与中等流速（125μL/h）和高流速（250μL/h）相比，低流速（60μL/h）的Papp明显较低，为1.4±0.3×10-7 cm/s：分别为2.6±0.7×10-7 cm/s和2.7±0.6×10-7 cm/s（图3B）。无论流速如何，加入25mM癸二酸钠和10mM单月桂酸蔗糖都能显著提高FD3的Papp。然而，在最高流速下，Papp的增加与低流速和中流速下观察到的增加有明显不同：NaCap高（83.3±57.2×10-7厘米/秒）与中等（8.2±4.1×10-7厘米/秒）和蔗糖单月桂酸高（64.3±37.9×10-7厘米/秒）与中等（11.8±4.2×10-7厘米/秒）。根据这些结果，60-125μL/h的流速是评估肠道渗透促进剂（PES）的最佳流速；但是，为了有足够的样品量进行分析，流速可能至少需要100μL/h。在其余的芯片实验中，默沙东的科学家们使用125μL/h的流速，NaCap浓度为25mM，蔗糖单月桂酸盐浓度为10mM。

图3.优化Caco-2肠道芯片的有效肠道渗透促进剂（PES）浓度和流速参数。(A)与Transwells相比，芯片系统中需要更高浓度的癸二酸钠（NaCap；粉红色）和蔗糖单月桂酸酯（绿色）来提高Papp。(B）改变低（60μL/h）、中（125μL/h）和高（250μL/h）流速对Papp有影响。

3 使用模拟肠液提高肠道芯片的生理相关性

接下来，默沙东的科学家们想评估模拟肠液（SIF）对芯片测定预测性能的影响。首先，默沙东的科学家们评估了空腹状态肠液（FaSSIF）和进食状态肠液（FeSSIF）与缓冲液（HBSS）相比对FD3Papp的影响。Transwell基础Papp为5.1±0.6×10-8cm/s，Chip基础Papp为1.9±1.6×10-7cm/s。在顶部通道中用缓冲液代替FaSSIF可使Transwell的Papp小幅增加4倍，芯片的Papp增加3倍（图4A）。相反，在Transwell顶端室中加入FeSSIF会使Papp增加4000倍，表明屏障完全被破坏。芯片屏障对FeSSIF的抵抗力更强，因为Papp只增加了20倍，低于在NaCap和蔗糖单月桂酸酯最高浓度下观察到的增加。这些数据表明，Chip模型适用于检测进食和空腹状态下的渗透性和制剂吸收研究。

默沙东的科学家们进一步确定了在渗透促进剂中使用FaSSIF的可行性。Transwell基础Papp为4.7±0.8×10-8cm/s，加入NaCap（10mM）和蔗糖单月桂酸酯（1mM）后，Papp分别增加了6倍和60倍。FaSSIF似乎与肠道渗透促进剂（PES）相互作用，因为使用FaSSIF作为Transwells顶端缓冲液时的Papp为17.2±5.3×10-8cm/s，添加NaCap和单月桂酸蔗糖后，Papp分别增加了8倍和1.5倍（图4B）。芯片基础Papp为1.5±0.2×10-7，添加NaCap和蔗糖单月桂酸盐后，Papp分别增加了2倍和20倍，而添加肠道渗透促进剂（PES）后，FaSSIF芯片Papp为2.9±0.2×10-7cm/s，分别增加了3倍和12倍（图4C）。在Transwell模型中，FaSSIF对肠道渗透促进剂（PES）疗效的影响更为明显，这与体内观察到的情况不符，这表明芯片模型具有更好的生理相关性，可能更适用于在临床前测试评估。

图4. 评估Transwells和芯片中模拟肠液(SIF)的效用。

(A)在Transwell和芯片中，向顶端添加空腹状态SIF（FaSSIF）和进食状态SIF（FeSSIF）可提高FD3的Papp。(B）渗透增强剂癸二酸钠（NaCap；粉红色）和蔗糖单月桂酸酯（SL；绿色）在Caco-2 Transwells的FaSSIF中显示出不同的功效。(C）Caco-2芯片在存在或不存在顶端FaSSIF的情况下保留肠道渗透促进剂（PES）的定向功效。

为了了解芯片模型在荧光葡聚糖分子之外的作用，默沙东的科学家们测量了胰岛素（线性肽）和奥曲肽（环状肽）的Papp。FITC-insulin的基础Papp为1.7±0.3×10-8cm/s（Transwell）和9.1±0.3×10-8cm/s（Chip；图5A）。加入NaCap后，Transwells和芯片中的Papp分别增加了3.5倍和2.5倍。单月桂酸蔗糖分别使Papp增加了300倍和20倍。奥曲肽的基础Papp为7.8±1.9×10-8厘米/秒（Transwell）和13.9±1.4×10-8厘米/秒（Chip；图5B），表明各模型的Papp相似。在Transwells和芯片中，加入NaCap会使Papp分别增加7倍和2倍，而蔗糖单月桂酸盐会使Papp分别增加140倍和8倍。芯片模型中肠道渗透促进剂（PES）存在时渗透性增加的趋势与体内外模型的观察结果更为吻合。

图5. Emulate肠道芯片在多肽药物渗透性评估中的应用。

(A)渗透促进剂癸二酸钠（NaCap；粉红色）和单月桂酸蔗糖（SL；绿色）在Transwell和芯片模型中都增加了FITC-胰岛素的Papp，而在芯片模型中相对增加较少（右图）。(B)在Transwell和芯片模型中，肠道渗透促进剂都会增加奥曲肽的Papp，而在芯片模型中，两种肠道渗透促进剂的增幅均小于10倍（右图）。

通过对紧密连接蛋白ZO-1进行免疫荧光染色，可以对Caco-2 Transwells和Emulate肠道芯片进行形态学评估。在静态条件下，培养在Transwells上的Caco-2细胞形成扁平单层，ZO-1呈"鹅卵石"状，这与之前的报道一致。在芯片顶端腔加入肠道渗透促进剂（PES）会引起扰动，导致ZO-1信号降低，这表明该蛋白重新定位（图6B）。需要注意的是，当染色溶液流经微流控通道时，芯片染色会导致上皮脱落。为便于比较，默沙东的科学家们提供了有效浓度的Caco-2 Transwell图像，显示在这些浓度下没有出现严重的扰动（图6C）。总体而言，Emulate肠道芯片的成像显示细胞屏障在暴露于肠道渗透促进剂（PES）后明显完好无损，没有任何明显的形态损伤。

图6. Caco-2肠道芯片的代表性免疫荧光分析（A）。

(B）未经处理或用25mMNaCap或10mM单月桂酸蔗糖处理2小时、125μL/h的Caco-2Chips的免疫荧光图像；（C）用10mMNaCap或1mM单月桂酸蔗糖处理Caco-2Transwells的免疫荧光图像。蓝色─DAPI；细胞核；红色─ZO1；紧密连接蛋白。

4 小结

强效多肽药物的口服给药给制药业带来了制剂方面的主要挑战：稳定性、溶解性和渗透性。肠道渗透促进剂可以通过改善药物渗透性来克服口服生物利用度低的问题。但评估肠道渗透促进剂的传统体外模型无法预测其在体内的疗效，其预测结果较差。在本研究中，默沙东的科学家们研究了在二维静态Transwell模型和三维Emulate肠道芯片肠道动态模型上培养的Caco-2细胞在筛选肠道渗透促进剂和口服多肽递送方面的相对效用。默沙东的科学家们建立了肠道芯片实验的基线特征，包括基础Papp（3.2±1.8×10-7cm/s）、流速（125μL/h）和两种模型渗透促进剂（己二酸钠和单月桂酸蔗糖）的有效浓度。例如，在Transwells中为10mM的己酸钠，而在芯片中为25mM。在芯片中引入禁食和进食状态模拟肠液（FaSSIF/FeSSIF）后，FD3的基础渗透性分别增加了3倍和20倍，而在Transwells中分别增加了4倍和4000倍。默沙东的科学家们评估了这一模型对含有肠道渗透促进剂（PES）s的多肽（胰岛素和奥曲肽）的实用性，在芯片模型中观察到的渗透性增强更为温和，与体内外临床前模型的观察结果一致。这些数据表明，Emulate肠道芯片模型相比传统模型人体生理仿真度更佳，是药物发现和药物开发体外工具包的有力补充。

Reference：Gleeson, John P et al. “Head-to-Head Comparison of Caco-2 Transwell and Gut-on-a-Chip Models for Assessing Oral Peptide Formulations.” Molecular pharmaceutics, 10.1021/acs.molpharmaceut.4c00210. 28 Jun. 2024, doi:10.1021/acs.molpharmaceut.4c00210