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红肉苹果！山东农大揭示介导苹果AsA与花青苷合成的新机制

学术 2025-01-12 14:00 上海

近日，山东农业大学园艺科学与工程学院陈学森团队在Plant Biotechnology Journal（IF2023：11.2）杂志在线发表了题为“The regulatory module MdCPCL-MdILR3L mediates the synthesis of ascorbic acid and anthocyanin in apple”的研究论文。该研究发现一个R3型MYB转录因子MdCPC-like（MdCPCL）能够结合到MdGLDH与MdANS的启动子上并激活其转录，进而促进苹果中抗坏血酸与花青苷的合成。进一步研究表明，MdCPCL能够与bHLH转录因子MdILR3-like（MdILR3L）在体内外相互作用，二者形成的异源二聚体能进一步促进下游关键基因的表达，进而加强抗坏血酸与花青苷的积累。该研究为丰富苹果抗坏血酸和花青苷合成代谢通路，开展红肉苹果品质育种提供了重要理论依据。

苹果（Malus domestica Borkh.）不仅是世界上最具经济价值的水果作物之一，更是人类补充各类营养物质的主要膳食来源之一。抗坏血酸（ascorbic acid, AsA）与花青苷均是植物次生代谢的重要产物，作为天然的抗氧化剂，它们不仅在植物生长和发育、信号转导和胁迫防御方面发挥着重要作用，更与人类健康密切相关。随着人们日益增长的对健康和品质生活的追求，苹果果肉中营养物质的存在越来越受到人们的重视。然而，作为人类必需微量元素的抗坏血酸在苹果果实中的水平极低，此外，目前大多数商业价值较高的苹果品种都是白色或灰白色的果肉，花青苷含量几乎为0。因此，解析苹果中抗坏血酸与花青苷的合成机理对改善果实品质及选育特色多样化优质苹果新品种具有重要意义。此前，同时介导苹果中抗坏血酸与花青苷合成的调控模块尚未见报道。

山东农业大学陈学森团队针对我国苹果种源依赖进口、品种同质化严重（富士系占总栽培面积的70%以上）及生产成本高等产业瓶颈问题，从资源挖掘入手开展苹果育种工作40余年，通过系统收集评价原始起源中心新疆野生苹果种质资源，挖掘创制出17份苹果优异种质，明确了营养、风味等重要品质性状的形成机理，育成了‘龙富’‘翠香’‘美红’等富营养、强风味、轻简化系列苹果新品种16个，推动了我国苹果产业转型升级和高质量发展。本研究以新疆红肉苹果（Malus sieversii f. niedzwetzkyana）杂种二代分离群体为试材，发现MdCPCPL-MdILR3L模块可以通过调控MdGLDH和MdANS的表达，进而同时介导苹果抗坏血酸和花青素的合成。全文主要研究结果如下：

1. 杂种二代株系成熟期果肉中AsA含量与MdGLDH的表达量及花青苷含量均显著正相关

研究者从团队前期构建的新疆红肉苹果杂种二代分离群体中随机选取了15个红肉与15个非红肉苹果(图1a)，对它们成熟期果肉中的AsA含量(图1b，c)和MdGLDH的相对表达水平(图1d，e)进行了分析。结果表明，红肉苹果果肉中AsA含量与MdGLDH的相对表达量均显著高于非红肉苹果(P < 0.01)。相关性分析揭示了AsA含量和MdGLDH表达量之间的强正相关性(r = 0.94，图1f)。此外，研究者对随机选取的30个苹果果肉中的花青苷含量进行了测定，并分析了其与AsA含量的相关性。结果表明，红肉苹果果肉中的花青苷含量同样显著高于非红肉苹果（P < 0.01；图1g，h）。相关性分析发现，AsA含量与花青苷含量呈正相关(r = 0.90，图1I)。这些结果表明，杂种二代株系成熟期果肉中的AsA与花青苷含量呈正相关，且MdGLDH可能是果肉中AsA合成的关键因子。

图1 杂种二代株系成熟期果肉中AsA含量与MdGLDH的表达量及花青苷含量均显著正相关

2. MdCPCL与MdGLDH的启动子结合并激活其转录

以MdGLDH的启动子为诱饵，通过酵母单杂交(Y1H)文库筛选技术，鉴定出一个R3型MYB转录因子MdCPCL。对MdGLDH启动子序列中的顺式作用元件分析发现，该启动子存在4个MYB转录因子的结合原件 (图2b)，凝胶迁移实验(EMSA)结果证实MdCPCL与其中两个MBS顺式元件结合(图2c)。进一步分析表明，在竞争性探针存在下，MdCPCL和MdGLDH启动子之间的结合强度降低，当用突变探针替换标记探针时，检测不到MdCPCL和MdGLDH启动子之间的结合(图2d，e)。荧光素酶报告实验(LUC)分析发现，MdCPCL显著激活MdGLDH的启动子并增强其转录(P < 0.05；图2f，g)。此外，ChIP-PCR与ChIP-qPCR的结果也证明了两者的结合，含有MBS顺式元件的MdGLDH的启动子片段在MdCPCL-GFP的转基因‘王林’愈伤组织中富集(图2h，I)。这些结果表明，MdCPCL能够直接与MdGLDH启动子上的MBS元件结合并激活其转录。

图2 MdCPCL与MdGLDH的启动子结合并激活其转录

3. 过表达MdCPCL促进苹果中AsA和花青苷的合成

由于MdCPCL绑定MdGLDH的启动子并促进其表达，研究者猜测MdCPCL可能参与AsA的合成。为了验证上述猜测，研究者获得了三个独立的稳定过表达的转基因‘王林’ 愈伤组织和三个独立的被CRISPR/Cas9敲低的转基因红色愈伤组织（图3a）。通过PCR扩增、蛋白印记分析和测序结果鉴定证实了转基因的存在（图3b，c，d）。与对照愈伤组织相比，过表达MdCPCL的愈伤组织中AsA与花青苷含量显著增加（P< 0.05；图3e，f），RT-qPCR分析表明，MdCPCL和MdGLDH的相对表达量同样显著增加（P < 0.05；图3h，j）。当MdCPCL被敲低后，结果相反（图3e，g，i，k）。此外，由于过表达MdCPCL还促进了愈伤组织中花青苷含量的增加，为进一步验证MdCPCL在苹果果实中的生物学功能，研究者进行了苹果瞬时注射实验。结果表明，MdCPCL过表达增加了MdGLDH、MdANS与MdUFGT的转录水平，导致AsA和花青苷在渗透部位周围大量积累，果实红色增加（图3l，n，o）；相反，抑制MdCPCL的表达降低了MdGLDH、MdANS与MdUFGT的转录水平，导致渗透部位周围的AsA和花青苷含量降低，果实红色减弱（图3m，p，q）。这些结果表明，MdCPCL在AsA和花青苷积累中具有积极的调节作用。

图3 过表达MdCPCL促进苹果中AsA和花青苷的合成

4. MdCPCL直接与花青苷合成途径的结构基因MdANS的启动子结合并激活其转录

鉴于过表达MdCPCL愈伤组织中MdANS和MdUFGT的表达量显著增加，研究者推测MdCPCL同样与MdANS和MdUFGT的启动子结合。Y1H实验(图4a，b)发现了MdCPCL只结合MdANS的启动子。对MdANS的启动子进行分析，发现其启动子序列包含两个MYB转录因子识别元件(图4c)，进一步通过EMSA，ChIP-PCR和ChIP-qPCR确定了MdCPCL绑定MdANS启动子上的MBS（TAACCA）元件（图4d，e，h，i，j）。LUC分析表明，MdCPCL可以显著激活MdANS的启动子并促进其转录（图4f，g）。这些结果表明，MdCPCL能够直接与MdANS启动子上的MBS元件结合并激活其转录，进而参与花青苷的合成。

图4 MdCPCL直接与花青苷合成途径的结构基因MdANS的启动子结合并激活其转录

5. MdCPCL-MdILR3L复合物加强AsA与花青苷的积累

在‘王林’愈伤组织中共转化了MdCPCL与MdILR3L，获得了三个独立并稳定的转基因愈伤组织（图5a），使用不同的标记抗体（图5b）及RT-qPCR分析验证了转基因的存在（图5e，f，g，h）。在光照培养下，共转化的转基因愈伤组织比单独过表达MdCPCL的愈伤组织积累了更多的AsA和花青苷含量（图5c，d），这表明MdCPCL-MdILR3L复合物加强了愈伤组织中AsA和花青苷的积累。EMSA进一步阐明了该复合物对MdGLDH和MdANS启动子的影响(图5i，j，k)，添加MdILR3L-GST后，MdCPCL与MdGLDH和MdANS启动子的结合强度显著增加，结果表明，MdCPCL和MdILR3L形成复合物，能增强后续与下游基因的结合。此外，荧光素酶报告实验表明，proGLDH/proANS::LUC与35S::CPCL + 35S::ILR3L共表达的发光强度比proGLDH/proANS::LUC + 35S::CPCL单独表达的发光强度更大（图5l，m，n，o）。这些结果表明，MdCPCL与MdILR3L相互作用能够促进下游关键基因的转录，加强AsA和花青苷的积累。

图5 MdCPCL-MdILR3L复合物加强AsA与花青苷积累

综上所述，该研究揭示了同时介导苹果AsA与花青苷合成的新机制。一方面，MdCPCL可以直接与MdGLDH和MdANS的启动子结合，促进二者的表达，从而促进AsA和花青素的合成；另一方面，MdCPCL与MdILR3L的相互作用可以进一步增强下游关键基因MdGLDH和MdANS的表达，进而加强AsA和花青苷的积累。该研究为进一步丰富苹果抗坏血酸和花青苷合成代谢通路，开展红肉苹果品质育种提供了重要理论依据。

山东农业大学园艺学院博士研究生邹琦和泰安市农科院助理农艺师鲍甜甜为论文共同第一作者，山东农业大学国家苹果工程技术研究中心/园艺学院苹果种质资源与育种团队陈学森教授和王楠教授为论文共同通讯作者。山东农业大学张宗营副教授、房鸿成副教授以及山东省果树研究所许海峰副研究员参与了该研究部分工作并提供了重要指导。该研究得到了山东省重点研发计划（2022CXPT021；2023CXPT013）、山东省自然科学基金（ZR2022MC017）等项目的资助。

论文链接：https://doi.org/10.1111/pbi.14567

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