1. ZmNRT 2.5与玉米苞叶宽变异相关
研究者对508份玉米自交系的第三片苞叶宽度展开表型鉴定，通过GWAS发现SNP峰值最高点位于Zm00001d011679的编码序列（CDS）中，编码高亲和力硝酸盐转运蛋白（NRT）成员（以下称为ZmNRT 2.5，图1a）。为了完全确定ZmNRT 2.5中存在的遗传变异程度，研究者对ZmNRT 2.5基因进行了重新测序，并结合苞叶宽度表型进行关联分析，发现位于编码区的3-bp InDel（InDel 1604）与玉米苞叶宽度的关联性最高（图1b）。InDel 1604导致ZmNRT 2.5的C末端存在或缺失一个苏氨酸残基。而后单倍型（Hap 1和Hap 2）分析发现， Hap 2群体的苞叶显著宽于Hap 1群体（（图1c，d）。Hap 2群体的苞叶和籽粒中NO3-含量显著高于Hap 1自交系（图1 e、f）。这些结果表明，ZmNRT 2. 5中的3-bp InDel影响玉米自然群体的苞叶宽度以及苞叶和籽粒中的NO3-含量。
图1 ZmNRT 2.5基因编码序列的自然变异与玉米苞叶宽度相关
2. ZmNRT 2.5蛋白与ZmNPF5蛋白的互作强度调控玉米苞叶宽度
为了评估ZmNRT 2.5蛋白中苏氨酸残基的存在或缺失对蛋白质结构的潜在影响，研究者利用蛋白结构预测网站进行预测发现ZmNRT2.5Hap1和ZmNRT2.5Hap2具有二级结构的差异。先前的研究已经报道了NRT 2家族成员与拟南芥中的NRT3.1相互作用(Jacquot et al., 2020; Kotur et al., 2012; Okamoto et al., 2006)，通过蛋白的同源比对锁定到玉米的另一编码转运蛋白基因ZmNPF5。因此，研究者通过烟草的双荧光素酶实验（LUC）和原生质体中双分子荧光互补实验（BiFC），表明ZmNPF 5确实与两种ZmNRT2.5单倍型相互作用，检测到ZmNPF 5和ZmNRT2.5Hap2的互作比ZmNPF 5和ZmNRT2.5Hap1的更强（图2a，b）。除此之外，研究者利用Pull-down 实验体外验证同样证实ZmNRT2.5两种单倍型与ZmNPF 5的相互作用的差异（图2c）。这些结果说明，ZmNRT 2. 5与ZmNPF 5共同参与调节玉米苞叶宽度。
图2 ZmNRT 2.5与ZmNPF 5蛋白间的相互作用
3. ZmNRT 2.5将硝酸盐从苞叶转移到籽粒
ZmNRT2.5是潜在的高亲和力转运系统（HATS）的成员。为了研究NO3-的协调利用，研究者进行了不同硝态氮供应条件下Zmnrt 2. 5 -1突变体及其野生型（ND 101）的田间试验。RT-qPCR分析显示，与高氮（HN）条件相比，低氮（LN）条件下高度诱导ZmNRT2.5表达（图3a）。在HN和LN条件下生长的Zmnrt2.5-1突变体中玉米苞叶的宽度显著窄于在相同条件下生长的野生型（图3b）。研究者还观察到，突变体Zmnrt2.5-1和野生型相比，在HN和LN条件下生长的苞叶和籽粒的NO3-含量显著降低，其中在LN条件下生长的苞叶和籽粒的NO3-含量相对于在HN条件下的含量降低更为显著（图3c，d）。这些结果表明，ZmNRT2.5参与了硝酸盐在田间从苞叶向籽粒的运输，在低氮条件下对硝酸盐的运输起着重要作用。
图3 高氮和低氮条件下玉米苞叶和籽粒中NO3-含量的变化
4. ZmNRT 2.5在玉米育种中的潜力
由于ZmNRT 2.5影响硝酸盐从苞叶到籽粒的运输，ZmNRT 2.5是否可能有助于玉米杂交种种子的蛋白含量。为此，研究者随机选择了20个Hap 1和20个Hap 2自交系，并将它们种植在铁岭试验点。来自Hap 2近交系的种子的蛋白含量（11.4%）比来自Hap 1近交系的种子的蛋白含量（10.8%）高5.7%（图4a）。Zmnrt2.5-1和Zmnrt2.5-2突变种子的蛋白含量显着低于各自野生型的蛋白含量（Zmnrt2.5-1为8.5%，ND 101为9.6%，Zmnrt2.5-2为8.4%，B73为9.4%；图4b、c）。将Zmnrt 2. 5 -1基因导入母本郑58和父本昌7 -2两个优良自交系，形成了我国栽培面积最大的玉米杂交种郑单958（ZD958），获得了ZmNRT2.5功能缺失的杂交种ZD958（命名为ZD958-Zmnrt2.5-1）。Zheng58-Zmnrt2.5-1和Chang7-2-Zmnrt2.5-1的种子蛋白含量与它们各自的野生型相比显著降低（图4d，e）。类似地，ZD 958-Zmnrt2.5-1种子的蛋白含量为8.1%，与ZD958种子（8.8%）相比，相应地降低了8.05%（图4f）。为探讨ZmNRT 2. 5功能缺失引起的籽粒蛋白含量变化对籽粒产量的影响，在铁岭地区进行了籽粒行数、行粒数和百粒重3个与籽粒产量直接相关的性状的测定。与其相应的野生型ZD958相比，ZD958-Zmnrt2.5-1植株在这三个籽粒产量性状均未表现出显著差异（图4g-i）。这些结果表明，ZmNRT 2.5具有提高玉米种子蛋白含量的潜力，但对产量没有产生负面影响。
图4 不同ZmNRT 2.5基因型玉米籽粒蛋白含量和产量
原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.14559
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