从癌症患者、孕妇或传染病患者的外周血中分离出的低密度中性粒细胞（Low-density neutrophils, LDN）具有免疫抑制功能，被称为多形核骨髓源性抑制细胞 (polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cell，PMN-MDSC)。由于PMN-MDSC中成熟和未成熟细胞混合，且缺乏特异性标记，因此难以对其进行精确的分子表征。2024年2月，意大利维罗纳大学Marco A. Cassatella团队在 Cell Reports Medicine 上发表了题为《Surface CD52, CD84, and PTGER2 mark mature PMN-MDSCs from cancer patients and G-CSF-treated donors》的文章，通过BD Rhapsody™ scRNA-seq联合流式及bulk RNA-seq，鉴定了成熟PMN-MDSC独特的基因特征以及表面分子标记CD52、CD84和PEGER2；另外作者还证实，来自接受G-CSF进行干细胞动员的健康捐赠者（healthy donors receiving G-CSF for stem cell mobilization，GD）的成熟抑制性中性粒细胞可代表PMN-MDSC进行机制研究。这些研究为成熟PMN-MDSC的选择性免疫监测和最终靶向治疗奠定了基础。
相关平台与应用
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实验结果
Result 1：鉴定NSCLC/HNC患者的mPMN-MDSC与GD的mNDN/mLDN共有的基因特征任务过半
初步实验证实，来自GD的mNDN（normal density neutrophils，NDN）和mLDN不仅抑制T细胞的增殖，而且显著抑制NK细胞介导的对肿瘤细胞的细胞毒性以及降低对K562细胞的细胞毒性（Fig1A-C）。这些数据证实：GD的mNDN和mLDN为功能性mPMN-MDSC细胞，因此随后研究了它们是否与癌症mPMN-MDSC存在“共享基因特征”。
选择NSCLC、HNC、GD以及对应的HD队列的mNDN/mLDN/mPMN-MDSC进行bulk RNA-seq实验，对500个变异程度最大的基因进行层次聚类以及主成分分析，显示来自不同肿瘤的mPMN-MDSC与来自GD的mNDN/mLDN存在共享转录程序（Fig1D-E）；随后使用似然比检验 (LRT) 和K均值聚类进行差异基因表达分析：将GD队列产生的7,506个DEGs（Differentially expressed genes，DEGs）分为9个簇，其中GD的mNDN /mLDN 的7个簇表现出一致的基因调节趋势（对应92%的DEGs，c1-c3上调，c6-c9下调）（Fig1F）；NSCLC和HNC队列产生的1,018 和5,075个DEGs各分为4个簇，其中mPMN-MDSC的c1簇完全由上调基因构成（分别对应于NSCLC或HNC队列总DEG的75%或79%）（Fig1G-H）。通过Jaccard index相似系数分析，最显著的相似性发生在来自GD mNDN/mLDN的c1+c2簇（占总共同上调DEG的85%)和来自NSCLC/HNC mPMN-MDSC的c1簇（Fig1I-J）。
选择GD的c1、c2簇以及NSCLC/HNC的c1簇基因，韦恩图显示共有1,930个 DEGs在NSCLC和/或HNC患者的mPMN-MDSC以及GD的mNDN/mLDN中普遍上调，定义为“mPMN-MDSC基因特征”（Fig1K）。对其进行基因富集分析，发现“mPMN-MDSC基因特征”与多种生物过程有关，例如代谢过程和对氧化应激的反应，通常表征与癌症相关的髓系细胞（Fig1L-M）。
总之，这部分结果鉴定到了NSCLC/HNC mPMN-MDSC与GD mNDN/mLDN共享的基因特征，反映了它们的免疫抑制/促肿瘤特征。
Fig1 鉴定NSCLC/HNC患者的mPMN-MDSC与GD的mNDN/mLDN共有的基因特征
1A-C：来自GD的mNDN和mLDN具有功能性PMN-MDSC特征；1D-J：GD mNDN/mLDN与NSCLC/HNC的mPMN-MDSC显示出相似的转录活性；1K-M：识别和表征NSCLC和HNC的mPMN-MDSC以及GD的mNDN/mLDN共有的基因特征
Result 2：利用scRNA-seq分析NSCLC-TAN和GD-mNDN/mLDN中“mPMN-MDSC基因特征”的富集情况
首先，作者通过分析发现“mPMN-MDSC基因特征”在文献报道的PMN-MDSC基因特征中显著富集，这些基因特征包括来自HNC/NSCLC患者的未分级PMN-MDSC（即包含成熟和未成熟的PMN-MDSC）和来自多发性骨髓瘤患者（multiple myeloma，MM）骨髓的总成熟中性粒细胞（曾被错误地定义为PMN-MDSC）的bulk RNA-seq数据集(Fig2A)；相比之下，无论是在系统性红斑狼疮 (systemic lupus erythematosus，SLE) 患者的促炎性mLDG转录组，还是从LPS处理的供体中分离的CD16highCD62Llow抑制性中性粒细胞的转录组中，“mPMN-MDSC基因特征”富集效果都非常差 (Fig2A)；另外，通过分析已发表的scRNA-seq公开数据集，“mPMN-MDSC基因特征”还在NSCLC患者的TAN亚群中显著富集（Fig2B-E）。
为了进一步验证“mPMN-MDSC基因特征”的可重复性，使用从GD的NDN和LDN以及HD的NDN分选出的CD66b+中性粒细胞，基于微孔板原理对粒细胞的天然优势，利用BD Rhapsody单细胞平台开展了scRNA-seq实验，再选择最成熟的中性粒细胞进行下一步分析（GD：10,339个mNDN+6,393个mLDN；HD：6,070个mNDN）（Fig2F-G）。三组数据合并UMAP图可视化分析显示（Fig2H），来自GD的mNDN与mLDN的相似性高于来自HD的mNDN，与bulk RNA-seq结果一致（Fig1D-F）。通过计算每个细胞“mPMN-MDSC基因特征”富集分数，来自GD的mNDN和mLDN富集程度显著高于HD的mNDN，并且GD的mLDN富集分数最高（Fig2I-J）。
综上，结果表明，“mPMN-MDSC基因特征”不仅能将mPMN-MDSC与促炎性mLDG区分开，还能将其与之前显示具有抑制功能的其他类型的成熟中性粒细胞群区分开。此外，scRNA-seq实验数据与文献数据相结合，证明“mPMN-MDSC基因特征”不仅在GD的mPMN-MDSC 中显著表达，而且在NSCLC患者的TAN亚群中也表达。
Fig2 scRNA-seq检测NSCLC-TAN和GD-mNDN/mLDN中“mPMN-MDSC基因特征”的富集情况
2A-E：分析公开数据集中“mPMN-MDSC基因特征”的富集情况；2F-J：利用GD-NDN/LDN和HD-NDN开展scRNA-seq实验，分析“mPMN-MDSC基因特征”的富集情况
Result 3：中性粒细胞祖细胞中“mPMN-MDSC基因特征”的表达
为了明确中性粒细胞分化的哪个阶段表达“mPMN-MDSC”基因特征，使用来自GD和HD的外周血及HD的BM样本，利用流式分选不同分化阶段的粒细胞进行bulk RNA-seq实验。选择500个变异最大的基因进行PCA分析，来自GD（Fig3A，蓝色箭头）和HD（Fig3A，粉色箭头）的中性粒细胞前体的成熟轨迹沿着相似的趋势分布，在晚幼粒细胞（metamyelocyte，MM）成熟阶段之后沿着PC2分开。整合“mPMN-MDSC基因特征”与来自GD/HD外周血或HD BM样本的未成熟和成熟中性粒细胞的转录组，通过K均值聚类分析分成三个主要基因簇；g1、g2和g3：g1簇基因在终末分化的中性粒细胞中几乎完全下调，另外癌症mPMN-MDSC中g1簇基因表达也高于自体或HD mNDN的水平；g2簇基因在PMN-MDSC/免疫抑制性细胞中选择性上调；g3簇基因仅在来自GD的mLDN中选择性上调（Fig3B-C）。GO富集分析显示，g1簇富集代谢重编程、对氧化应激的反应等生物过程；g2簇富集与PMN-MDSC免疫抑制活性相关的生物过程（即细胞活化和胞吐、白细胞介导免疫的负调节等）；g3簇在与免疫细胞刺激和信号传导更普遍相关的基因中富集，而非PMN-MDSC相关基因（Fig3D-F）。
随后，作者还研究了“mPMN-MDSC基因特征”是否在最不成熟的中性粒细胞前体即中性粒细胞定向祖细胞 (neutrophil-committed progenitor cells，NCP)的四个scRNA-seq簇中富集。如图3G-J，只有g1簇在四个NCP簇中均富集，g2和g3则均未富集。
综上，NCP或更成熟的中性粒细胞前体（即PM、MY、MM和BC）不表达整个“mPMN-MDSC基因特征”这一事实表明，要分化形成mPMN-MDSC，中性粒细胞必须在其成熟过程中经历特定的转录重编程。
Fig3 中性粒细胞祖细胞中“mPMN-MDSC基因特征”的表达
3A-F：GD外周血中性粒细胞前体与HD骨髓中性粒细胞前体细胞的“mPMN-MDSC基因特征”表达比较；3G-J：文献报道的NCP scRNA-seq数据集中，g1、g2、g3簇的基因得分
Result 4：g2基因编码的表面分子在癌症患者和GD的mPMN-MDSC上显著升高
作者重点关注“mPMN-MDSC基因特征”的g1和g2簇（包含GD的mNDN和mLDN所共有的基因），以分析是否包含编码mPMN-MDSC特异性标志物的基因。首先分析g2簇基因（在HD和GD之间表现出最强的差异表达），重点关注编码表面分子CD52（也称为CDW52、EDDM5和HE5）、CD84（也称为LY9B和SLAMF5）和PTGER2（也称为EP2）的基因。RT-qPCR结果显示：CD52、CD84、PTGER2在HNC/NSCLC的mPMN-MDSC中表达高于自体mNDN；在GD的mNDN/mLDN中表达高于HD的mNDN（Fig4A-C）。流式结果与RT-qPCR一致，且三个表面分子在mPMN-MDSC上的总体水平都高于来自GD的自体 iLDN或各个肿瘤队列的iPMN-MDSC（除了NSCLC的CD52）（Fig4D-L）。综上，成熟PMN-MDSC特异性表达表面分子CD52、CD84和PTGER2。
Fig4 g2基因编码的表面分子在癌症患者和GD的mPMN-MDSC上显著升高
4A-C：RT-qPCR检测不同队列中CD52、CD84、PTGER2基因的表达情况；4D-L：流式细胞术检测不同队列中表面分子CD52、CD84、PTGER2的表达情况
Result 5：g1簇基因编码的表面分子LOX-1和LAIR-1在癌症患者和HD的未成熟中性粒细胞中显著升高
最后，作者评估了g1簇基因编码的表面分子的表达。LOX-1由OLR1编码，曾被认为是PMN-MDSC的标志物（总PMN-MDSC），LAIR-1/CD305已知在调节癌症免疫反应中发挥重要作用的抑制性受体。RT-qPCR结果显示：与对照mNDN相比，OLR1在GD-mLDN、NSCLC/HNC的mPMN-MDSC中上调，LAIR-1在GD-mNDN/mLDN、 NSCLC/HNC的mPMN-MDSC中上调（Fig5A-B）。流式结果显示：NSCLC/HNC的iPMN-MDSC显示出比自体mPMN-MDSC更高的LOX-1表达水平（Fig5C、E、G）；GD的iLDN和癌症患者的iPMN-MDSC显示出比来自HD或自体mPMN-MDSC和mNDN更高的LAIR-1表达水平（Fig5D、F、H）；另外，与来自HD外周血的mNDN或BM的mLDN相比，HD BM 的iLDN也显示出表面分子LOX-1和LAIR-1的表达显著增强（Fig5I-J）（与Fig3B中RNA-seq趋势一致）。综上，表面分子LOX-1和LAIR-1表达在iPMN-MDSC和未成熟正常中性粒细胞上均升高，不能特异性标记mPMN-MDSC。
Fig5 g1簇基因编码的表面分子LOX-1和LAIR-1在癌症患者和HD的未成熟中性粒细胞中显著升高
5A-B：RT-qPCR检测不同队列中OLR1和LAIR1基因的表达情况；5C-J：流式细胞术检测不同队列中表面分子OLR1和LAIR1的表达情况
总结
本文利用bulk RNA-seq、BD Rhapsody scRNA-seq及流式细胞术确定了成熟 PMN-MDSC的基因特征，并且该基因特征在已发表的NSCLC患者TAN亚群的转录组中也显著富集。对此类基因特征的分析揭示了与mPMN-MDSC分化相关的特定转录程序，并最终确定实体瘤以及GD 中，CD52、CD84和PTGER2能够代表潜在的mPMN-MDSC相关标记。总之，该研究结果表明成熟的PMN-MDSC在分化过程中会经历特定的重编程，并为成熟PMN-MDSC的选择性免疫监测和最终靶向奠定了基础。
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