BD Rhapsody™ 技术助力FMT
A single-cell map of peripheral alterations after FMT treatment in patients
with systemic lupus erythematosus
Journal of Autoimmunity
12.8
01
前言
系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus, SLE)是一种典型的长期炎症性自身免疫性疾病。其特点是丧失自我耐受性和持续的自我攻击，持续的慢性炎症，产生自身抗体和多系统损伤，迄今为止在很大程度上是无法治愈的。与健康人相比，SLE患者肠道微生物组的丰富度和多样性较低，一些属和种被发现与狼疮活动有关。因此，通过粪便菌群移植(fecal microbiota transplantation, FMT)探索性临床试验，发现FMT通过调节肠道菌群及其代谢谱有可能是SLE患者一种可行、安全、有效的治疗方法。
该研究利用BD Rhapsody scRNA-seq技术详细展示了FMT治疗前后SLE患者外周血免疫系统的变化，为FMT治疗SLE的有效性提供了一定的证据。
02
单细胞平台与技术
BD Rhapsody™ 单细胞多组学分析平台
BD Rhapsody™单细胞成像仪（货号633701）
BD Rhapsody™上样工作站（货号633702）
BD Rhapsody™ Cartridge配套试剂盒（货号633731）
BD Rhapsody™ 反转录试剂盒（货号633773）
BD Rhapsody™ 全转录组扩增试剂盒（货号633801）
BD Rhapsody™ 微孔板（货号633733）
BD Rhapsody™人多样本标记试剂盒（货号633781）
03
研究方案
本研究首先征集了13个SLE患者，这些患者SLEDAI-2K（系统性红斑狼疮疾病活动指数-2K）均为至少6分。对所有患者除标准背景治疗外，进行每周30粒FMT胶囊药物治疗，连续给药3周(第0、1和2周)，在第0周(V0)、第4/5周(V4/V5)和第12周(V6)评估患者的FMT治疗应答性，将治疗后患者分为应答组和非应答组、同时在0、4/5、12周的预定时间点采集患者外周血样本，分离外周血中的PBMC并冻存。3个月后，复苏冻存的PBMC并利用BD Rhapsody™ 单细胞平台进行单细胞测序分析。（图A）
04
研究结果
单细胞测序显示FMT治疗后T细胞减少，NK细胞增加
应用BD Rhapsody™ 单细胞平台对13例FMT给药SLE患者治疗前和治疗后样本的30个样本进行单细胞测序。获得高质量单细胞数据后，共鉴定出18个细胞亚群，共109,530个细胞(治疗前44,086，治疗后65,444)。FMT治疗后T细胞占总淋巴细胞的38.8%，低于治疗前的53.3%，而NK细胞的比例为22.9%，高于FMT治疗前的比例3.5%(图1A)。对比治疗前后匹配的样本，治疗后T细胞百分比显著降低(图1B)。治疗后只有FMT应答组的T细胞比例显著降低，而治疗后FMT应答组NK细胞表达上调 (图1C)。淋巴细胞中T细胞的比例与SLEDAI水平呈微正相关，FMT治疗前后T细胞比例的倍数变化与尿蛋白/肌酐的倍数变化呈显著正相关。(图1D)
FMT治疗后相关淋巴细胞亚型的鉴定分析
研究将所有淋巴细胞合并进行亚聚类分析后划分为35个亚群，发现FMT治疗后应答组中CD8+ Effector-NKG7和CD8+ Effector-memory-NKG7的比例显著升高，而CD4+ Naive和CD8+ Effector-GZMK的比例较治疗前显著降低。FMT治疗增加了CD8+ Effector memory-NKG7, CD8+ Effector- GZMH和CD8+ Effector-NKG7以及CD8+ 增殖细胞的细胞毒性评分，而CD8+ Effector- GZMH的细胞毒性评分显著降低(图2A)。FMT治疗后CD8+ T细胞的拟时序分析显示，高表达MKI67、TOP2A和IGFBP7的CD8+ 增殖T细胞可能分化为高表达GZMH和CD8A的CD8+ Effector-NKG7 (图2B)。
FMT治疗前后无反应组和有反应组中CD4+ T细胞和CD8+ T细胞基因特征的变化
FMT治疗SLE虽有一定疗效，但患者间疗效存在差异。分析结果显示，与应答组相比，无应答组CD4+ T、CD8+ T、DP、B细胞中IFITM3、IFI6等干扰素相关基因(IRGs)的表达相对较高(图3A-3B)，提示这些IRGs的表达与FMT疗效可能存在相关性。相关分析证实干扰素相关基因在所有淋巴细胞中的表达与FMT疗效呈负相关(图3C)。
FMT治疗后髓系细胞亚型的变化
研究发现所有骨髓细胞亚群在FMT治疗前后反应组与非反应组之间均无统计学差异(图4A～4D)。但从CD14+ CD16+ 单核细胞的差异基因分析显示，治疗前先天免疫相关基因GBP1、GBP5、GBP2、GBP4和MHC - II类分子编码基因HLA-DQA1过表达，而单核细胞中调节吞噬体成熟的基因LYST和蛋白激酶结合基因JUP在治疗后上调(图4D)。治疗后CD14+ CD16+ 单核细胞的趋化因子和受体评分明显降低(图4E)
髓系细胞对FMT治疗的基因反应
FMT治疗后，发现无应答组和应答组的单核细胞中NAIP、MS4A6A等15个常见基因以及树突状细胞中ITM2C、FCER1A等194个常见基因上调(图5A和5D)。无应答组单核细胞和树突状细胞中，IRGs的基因表达如IFI6、IFI44L等均高于应答组(图5B和5E)，同时应答组的CD14+ 单核细胞、CD16+ 单核细胞、cDC和pDC中的IRGs评分均显著低于无应答组(图5G)。所有细胞中IRGs的表达也被证明与FMT效率呈负相关(图5H)。GO功能富集分析验证了I型干扰素信号通路在无应答组单核细胞中富集(图5C)。在无应答组和应答组中，T细胞活化、中性粒细胞趋化和白细胞增殖通路在FMT治疗后的单核细胞组中均有富集(图5C)。
FMT治疗前后细胞间通讯分析
FMT治疗后，B细胞与单核细胞、CD8+ T细胞和NK细胞等杀伤细胞之间的相互作用对增加。CD8+ T细胞与DP T细胞、NK细胞和B细胞的通讯增强， CD4+ T细胞增加了与单核细胞和DCs的通讯(图6A-B)。单核细胞和NK细胞中CXCL2_CXCR2相互作用对平均表达增加，B细胞和DP细胞中CD72_SEMA4D相互作用对平均表达增加。HLA-F_KIR3DL2和CCL3L1_DPP4分别在B | NK细胞和DC | DP细胞种的相互作用水平降低(图6C)。DC/单核细胞/NK细胞中表达的TYROBP与DC、DP细胞和单核细胞中表达的CD44相互作用，DC/单核细胞/NK细胞中表达的CCL4L2与单核细胞/DC/NK/DP中表达的VSIR相互作用(图6D)。
05
总结
本研究通过BD Rhapsody™ 单细胞平台对接受FMT治疗的患者的PBMCs进行了单细胞转录组测序分析。研究发现FMT治疗后SLE患者外周血T淋巴细胞减少，NK细胞增加；CD4+T细胞高表达IL7R、CD28；CD8+T细胞高表达GZMH和NKG7基因。FMT治疗降低了SLE患者CD4+T、CD8+T、DP、NK和B细胞中干扰素相关基因(IRGs)的表达。更重要的是，FMT无应答组细胞中干扰素相关通路更加丰富，淋巴细胞和骨髓细胞中干扰素基因表达与FMT治疗效率呈负相关。该研究确定了FMT治疗后各种免疫表型和相关基因集的变化，阐明了FMT治疗后SLE免疫细胞的变化，有助于我们更好地认识FMT治疗SLE的机制。
