BD Rhapsody™ 单细胞蛋白组学研究助力同一次实验中实现单细胞转录组+单细胞蛋白组多组学研究。BD AbSeq能够同时获得高参数蛋白质表达数据与单细胞RNA-Seq数据，从而显著提高单细胞的探索深度。通过添加额外的细胞类型特异性信息来更清楚地定义细胞特异性，改善细胞类型的聚类属性，发现新的靶标，深度探索与疾病相关的生物学机制。
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背景介绍
单细胞测序技术日渐成熟，越来越多的学者通过单细胞多组学技术更新着对复杂血液病的认识，今天小编为大家分享一篇发表在Nature immunology（IF=25.606）上题为Single-cell proteo-genomic reference maps of the hematopoietic system enable the purification and massive profiling of precisely defined cell states的高分文章。本文作者用健康志愿者和急性髓细胞白血病（AML）患者的骨髓和血液样本，流式分选目的细胞，结合深入的单细胞多组学分析，全面解析了造血系统基因和蛋白的表达图谱，为AML治疗提供了有力的依据。
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技术亮点
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BD Rhapsody单细胞仪器、试剂盒及分析平台：
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BD Rhapsody single cell system
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BD Rhapsody人多样本标签试剂盒（human single cell multiplexing kit）
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BD Rhapsody单细胞WTA全转录组试剂盒（WTA Reagent Kit）
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BD Rhapsody单细胞TTA靶向转录组试剂盒（462 targeted genes）
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BD Rhapsody AbSeq膜表面蛋白定量产品（97 AbSeq panel、197 AbSeq panel）
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BD Rhapsody Analysis Pipeline
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BD FACS流式细胞仪
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FACS Aria Fusion II cell sorter、FACS Aria Fusion cell sorter、BD LSRII flow cytometer
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实验设计
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主要结论
作者用单细胞多组学方法共鉴定出45种细胞类型，包含难以检测的细胞毒性CD4+ T和间充质干细胞等（图1b）。对比仅做mRNA或AbSeq，多组学方法识别到更多细胞类型，有更高的分辨率。
单细胞分析发现，两个健康组样本之间细胞聚类相似，但健康组和AML组之间差异显著，且在AML组内部也有较大差异（图1b）。同时对比了同一个样本的WTA和TTA数据，显示作者设计的462个靶向基因可以覆盖WTA的细胞分型。
作者提供了可查询数据，包括对一位健康志愿者的骨髓和血液样本进行TTA+197AbSeq多组学分析得到的非常全面的表达图谱（Ext图4c）、一位健康志愿者骨髓细胞的WTA+97AbSeq允许查询更多基因、用CD34+CD38-骨髓细胞的WTA+97AbSeq允许查询更多基因、用CD34+CD38-骨髓细胞的97AbSeq以提供更高分辨率的未成熟HSPCs信息以及12位AML患者的单细胞多组学数据。作者开发的AbSeq APP（https://abseqapp.shiny.embl.de/）及匹配介绍视频，允许访问本文资源进行可视化及其差异分析。
基于流式分选鉴定HSCs分化过程的已知surface marker有限，通过对CD34+ HSPC数据的拟时序分析，确定了HSCs向红细胞、巨科细胞、单核细胞、树突状细胞或B细胞分化轨迹进展相关的表面marker（图2d、3a），比如作为泛分化的marker CD38、分化早期B细胞的marker CD10、分化早期单核细胞的marker CD11c（图2d、扩展图6a），以及新泛化marker CD98（图2d）。
此外，作者揭示了可区分不同分化阶段的新表面marker，包括CD326（红细胞相关，图3d-e）、CD11a和Tim3（髓细胞相关），并基于流式index sorting联合smart-seq2或细胞培养的方法进行了验证（图3b-c）。同时分析了B细胞分化过程中的表面marker动态（扩展图6i）。
作者也详细列出了AbSeq在不同细胞类型、分化阶段、生物学过程中的表达情况（附表、扩展图5），以及对细胞亚群注释的markers清单，这为科研人员对HSPC分化过程鉴定及流式分选marker设计等研究提供了很有力的依据。
为了研究健康衰老过程中的表面蛋白表达，作者比较了年轻和年老的健康个体的骨髓单细胞AbSeq数据，发现其高度相似（图4a），但受年龄影响，细胞毒性效应CD8+ T细胞显著累积、一些免疫调节分子表达出现变化（图4b-c）。这表明在健康衰老过程中，表面蛋白表达的总体模式广泛维持，但有些免疫调节分子的表达发生了显著变化。
对比健康老龄组和AML组AbSeq数据（图4h），发现了CD152和CD274潜在药物靶点，AML骨髓细胞分化进程可能是靶向免疫治疗选择的关键。对来自相同分化阶段的AML和健康细胞进行差异分析，看到了在白血病细胞中特异过表达的markers（图4i）。
基于AML患者之间显示出的巨大差异性，作者深入分析了共15位AML患者的单细胞测序数据（扩展图7b），将细胞投射到“查询”绘制出了白血病细胞的分化阶段（图4b）及细胞积累状态（图4e）、不同marker与不同AML疾病亚型之间的对应（图4g）。
目前分离罕见和特征较差的细胞亚群仍然具有挑战性，作者探索了机器学习方法来定义数据驱动的设门方案，实现更高纯度（图5a）。
Hypergate算法显示细胞毒性T细胞有CD4+CD8-免疫表型，流式分选（图5d）并进行基因表达分析，证实了该群体中细胞毒性基因的表达（图5f）。骨髓间充质干细胞 也被同样证实（图5i,k）。
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讨论
作者描绘了一份涵盖45种细胞亚群人血液和骨髓的图谱，和HSC分化、健康老龄化和白血病阶段的97和197个表面蛋白标记的表达。首次利用单细胞膜表面蛋白-基因表达数据系统地设计和解释流式细胞术实验最准确地反映了单细胞多组学层面的细胞异质性，将作为血液学和免疫学的重要资源。
