BD Rhapsody™ 单细胞联合流式，揭示内脏脂肪组织中的两种调节性T细胞群决定全身代谢

文章背景

应用

单细胞测序样本

文章概要

一、VAT Treg的异质性分析

作者首先通过BD Rhapsody™ 单细胞RNA-seq，对22周龄雄性和雌性小鼠VAT中分选的CD4⁺ T细胞进行聚类分

析，得到TH1、TH2、Foxp3⁺Treg等细胞亚群 (图1a）。对Foxp3⁺ Treg细胞进行重聚类分析得到5个cluster(图1b)，cluster3、4和5都表达典型VAT Treg细胞转录本Il1rl1，被Gzmb、Il10、Areg的表达分开，代表先前报道的ST2⁺ VAT Treg细胞的不同激活状态，cluster1、2缺乏典型VAT Treg细胞转录本, cluster2高表达CXCR3，cluster1为双阴性细胞群（ST2^-CXCR3^-）。整体来讲，ST2⁺ VAT Treg（cluster3、4、5）在雄性小鼠中占主导地位，而CXCR3⁺ Treg细胞在雌性小鼠中占主导地位(扩展图1d)。

接下来作者借助流式和Bulk RNA方法验证，结论与单细胞测序一致（图1c-e）。

二、ST2⁺和CXCR3⁺ VAT Treg细胞的分化模式

为了解ST2⁺和CXCR3⁺ Treg在不同生理条件下的发育动力学，作者对不同周龄和不同喂养方式的小鼠进行了研究。

7周龄雄雌鼠具有相似比例的ST2⁺和CXCR3⁺VAT Treg细胞(扩展2a)，但随着雄鼠衰老,VAT Treg细胞积累(扩展2b), 主要是ST2⁺ Treg(图2a上)。相比雄鼠，雌鼠VAT CXCR3⁺ Treg始终占主导(图2a下)。

体重和肥胖，与ST2⁺ Treg细胞的数量呈正相关(图2b)，但与CXCR3⁺ Treg呈负相关(图2b-c)。在高脂饮食雄鼠中，VAT Treg细胞频率下降，同时ST2⁺ VAT Treg细胞数量减少，这与上述的自然进程结果相反，但雌鼠增加（图2d左）。CXCR3⁺ Treg细胞数量未受高脂饮食影响（图2d右）。

因为前期文献中对于ST2⁺ VAT Treg细胞起源的观点不同，所以作者在此也在重点研究了VAT Treg细胞前体的问题，更新了此前的结论。scRNAseq的轨迹分析发现，细胞分化始于cluster1（CXCR3^- ST2^-) Treg细胞(DN)，并分叉为ST2⁺和CXCR3⁺ VAT Treg(图2e)，DN表达CD62L。流式验证发现，很大部分DN Treg细胞表达CD62L和转录因子TCF1(图2g)，通常与增殖和自我更新相关，表明是两类成熟VAT Treg细胞的前体。所以最终确认CXCR3⁺和ST2⁺ VAT Treg细胞是从一个共同的CD62L⁺TCF1⁺ Treg（DN）细胞前体发育而来，并能对高脂饮食或生态位变化做出动态反应。

三、GATA3是ST2⁺ VAT Treg细胞的关键调节因子

转录因子GATA3是皮肤和肠道中Treg细胞分化所必需的，可调节ST2表达。然而GATA3在VAT Treg细胞分化和功能中的作用尚未得到研究。

作者首先通过流式分析发现GATA3在ST2⁺ VAT Treg细胞中特异性表达(图4a），与scRNAseq数据一致。为了研究GATA3的作用，构建Gata3^fl/flFoxp3^Cre小鼠（在Treg细胞中特异性消融GATA3)，发现ST2+ VAT Treg细胞均显著减少(图4c）。Bulk RNA分析发现，GATA3缺失的VAT Treg细胞缺乏ST2⁺ Treg细胞特征，但获得CXCR3⁺ VAT Treg基因特征(图4i、j）。

同时作者发现ST2⁺ VAT Treg关键功能分子（GzmB、CD25、Areg）的表达需要GATA3(图4k)，这表明它对ST2⁺ VAT Treg的功能非常重要。接下来作者利用Bulk ATAC分析发现，在ST2⁺富集的VAT Treg细胞可及染色质区域中，GATA3结合位点被富集(扩展图4c)，有验证的Tbx21 (T-bet)基因座上的GATA3结合位点(图4l)，表明GATA3通过抑制Tbx21，直接促进ST2⁺ Treg细胞的分化，同时抑制CXCR3⁺ VAT Treg细胞分化。

最后，作者通过scRNA分析了ND和HFD喂养小鼠的VAT CD4⁺T细胞，与对照组相比，HFD小鼠ST2⁺ Treg cluster3中的Gata3表达显著下调(图4O)。表明HFD通过驱动GATA3下调来驱动ST2⁺Treg细胞丰度和功能的丧失。

所以GATA3是ST2⁺VAT Treg分化和CXCR3⁺ Treg抑制的命运所需要的，并且在促进ST2⁺VAT Treg细胞维持和功能所需基因的表达方面具有重要作用。此外，由Tbx21编码的T-bet是Cxcr3的关键调控因子，经过类似的实验内容（敲除模型小鼠）表明，T-bet是CXCR3⁺VAT Treg细胞分化所特异性需要的，并限制了ST2⁺Treg细胞的分化。

四、ST2⁺和CXCR3⁺ Treg细胞调节VAT生理和代谢

鉴于ST2⁺和CXCR3⁺ Treg细胞之间的显著差异及其在VAT中的性别特异性分布，作者假设这两个亚群以独特的性别特异性方式促进VAT炎症抑制和代谢维持。为了验证这一观点，比较了缺乏ST2⁺（Pparg^fl/flFoxp3^Cre）或CXCR3⁺ VAT （Tbx21^fl/flFoxp3^Cre）Treg细胞的小鼠的VAT免疫细胞组成和葡萄糖耐量。

综上，表明ST2⁺和CXCR3⁺ VAT Treg细胞以饮食和性别依赖的方式合作控制VAT炎症和葡萄糖耐量。