2024年第9期文章推荐 || 家鸡羽毛结构色的定量检测方法探究

目前世界上有超过一万多种鸟类，他们的羽毛呈现出各种各样的色彩和图案，羽毛颜色不仅可以帮助他们更好地融入环境，从而躲避天敌的攻击，还可以使他们从竞争者中脱颖而出，提高对异性鸟类的吸引力。根据羽毛颜色形成的原理，可以将其分为色素色和结构色两种。羽毛色素色主要是由黑色素[1]和类胡萝卜素[2]等色素分子产生，其中类胡萝卜素可以使羽毛结构呈现出更明亮的色调，但鸟类本身无法生成类胡萝卜素，只能通过采食含有相应色素的食物进行摄取。而黑色素则可以在机体内的黑色素小体中合成并储存[3]。黑色素的本质为酪氨酸衍生物，分为真黑色素（Eumelanin）和褐黑色（Pheumelanin）两大类，真黑色素与羽毛黑色或者深棕色有关，褐黑色素与羽毛的黄色或者红色相关[4]。结构色与色素分子没有直接关系，它的形成是光线透过羽毛时发生衍射和干涉[5]的结果，这种影响会使得在变换视角观察的过程中，羽毛颜色呈现出青、绿、紫红色等各种颜色的变化，从而产生独特的虹彩效果。与普通色素色相比，结构色具有环保、不易褪色、虹彩效应等特点[6]。有研究称羽毛中黑色素和角蛋白含量的变化能够影响羽毛的光线折射率，从而影响羽毛结构色的形成[7]。

家鸡羽毛中的结构色具有一定的观赏价值和经济价值，特别是在黑羽鸡当中，具有蓝绿色金属光泽的 “黑得发亮” 的黑羽鸡往往更易受到市场的欢迎，例如有“兰博鸡尼” 之称的Ayam Cemani 鸡，我国的狼山鸡、寿光鸡和荆门黑羽绿壳蛋鸡等。其中荆门黑羽绿壳蛋鸡是一种以金属光泽丰富而著称的优质地方蛋鸡品种，还具有通身黑羽、白皮、青胫、产绿壳蛋等特征，对荆门黑羽绿壳蛋鸡进行羽毛结构色的特色化选育，特别是增强母鸡的结构色以提高淘汰蛋鸡的价值，有利于地方品种的开发利用。

对于颜色的量化通常有Lab 和RGB 两套系统，其中Lab 色彩模型使用a、b 和L 坐标轴定义色彩模型。L 代表光亮度，取值范围为0～100；a 值的取值范围为-128～127，正数表示偏红色，负数表示偏绿色；b 值的取值范围为-128～127，正数表示偏黄色，负数表示偏蓝色[8]。RGB 色彩模型通过红（R）、绿（G）、蓝（B）三个颜色通道的变化以及它们相互之间的叠加来得到各种各样的颜色，三种数值的取值范围均为0～255[9]。但是上述系统和指标是否能适用于对家鸡的羽毛结构色的定量，以及采集什么部位、用什么方法获得照片等问题目前没有进行过系统地研究。关于检测方法，目前国内外对于家禽羽毛结构色的研究进展均较少，Ma 等[10]在研究野鸭羽毛的绿头性状的过程中，通过测量黑色素的含量和黑色素小体的数量来实现对结构色的定量。Huang 等[11]在研究羽毛颜色性二态性和性连锁的关系的试验中，基于反射率将羽毛分为了浅色和深色两类。胡玲[12]在进行羽毛颜色测量的过程中使用相机对单根羽毛进行拍照，然后利用Image j软件对RGB 颜色模型的数值进行提取，但该方法无法克服外界光线、拍照角度等对羽毛图片颜色的影响。

因此，本研究着眼于对黑鸡羽毛结构色的定量方法进行探究，首先在小群体中进行采样，以分析合适的测量部位以及稳定可靠的测定指标，之后扩大数据测定的样本量并使用Excel 等计算工具对数据进行分析，计算各候选指标的狭义遗传力，建立起对黑羽鸡羽毛结构色进行定量检测的标准方法，使得个体之间、群体之间的表型比较成为可能，以期筛选到能够准确量化羽毛结构色的光学指标，为羽毛颜色的特色化选育奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验选择神地农业科贸有限公司的735 只荆门黑羽绿壳蛋鸡成年母鸡（周龄为34～42），其中5 只用于结构色定量指标和采样部位的筛选，730 只用于结构色定量指标遗传力的估计和显著性检验。

1.2 样品采集

（1）准备数量充足的自封袋，并以3 个自封袋为一组用橡皮筋捆扎好；

（2）在同一鸡舍房间同一位置、同一时间（保证光源角度的一致性）对5 只黑羽鸡进行多角度拍照以及视频记录，以便获得用于评估其整体结构色强弱程度的影视资料；

（3）修剪采集上述5 只个体的鞍羽、次级大覆羽和肩羽，修剪采集730 只个体的次级大覆羽；

（4）将采集修剪好的单个羽毛分别装入自封袋避光保存，并用记号笔在自封袋上进行编号以便于区分。

1.3 测定方法

1.3.1 照片获取方法

以10 根羽毛为一组，将羽毛粘贴在白纸上并标记羽毛编号，并使用扫描仪（佳能MG3680）进行扫描得到电子图片。

1.3.2 羽毛光学特征指标的提取

在获取扫描得到羽毛电子图片后，使用Digital color meter 软件（Version 5.22）中的Lab 和RGB 两种色彩模型对羽毛的结构色进行分析（图1），选用最多像素点模式（11×11）对图1 中红色三角形所示区域（即羽毛的中间偏顶端部位，结构色相对较明显）进行测定，每根羽毛采取三个点进行测量，相同的指标之间计算均值。剔除形态不整齐、无法观察到采集区域的羽毛，最终剩余671 只个体数据。

图1 使用软件对羽毛结构色进行测定示意图
Fig.1 Schematic diagram of the determination of feather structural color using software

图2 羽毛结构色强弱个体示例
Fig.2 Examples of chickens with strong or weak structural color of the feathers

注：左图为有明显结构色个体，右图为无明显结构色个体。
Note:the left image shows individuals with obvious structural color,and the right picture shows individuals without obvious structural color.

1.4 数据分析

1.4.1 结构色定量指标的筛选

通过肉眼观察将来自5 只个体的15 个羽毛样品进行分组，分为羽毛结构色的强组（Group A）和弱组（Group B），对上述测得指标的均值进行t 检验，分析各指标在羽毛自身结构色强与弱两组之间的差异性，并利用GraphPad Prism 9.5软件绘制柱状图。

1.4.2 羽毛采样部位的筛选

根据5 只个体的影视资料，通过肉眼观察分为整体结构色强的3 只个体（Group 1）与整体结构色弱的2 只个体（Group 2）。根据该个体分组将每只个体所有3 个部位的羽毛分为两组，对上述测得指标的原始数据（每根羽毛3 次测定）进行t 检验分析，得到鸡只整体结构色强与弱两组各部位羽毛定量指标之间的差异性，并利用GraphPad Prism 9.5 软件绘制柱状图。

1.4.3 定量指标正态性检验以及稳定性的评判方法

正态性检验是统计学中用于检验一组数据是否服从正态分布的一种方法。使用SPSS statistics 23 中的Kolmogorov-Smirnov 检验对定量指标进行正态性检验，P＞0.05 说明数据符合正态分布，P＜0.05 说明数据不符合正态分布。

变异系数是标准差与平均数的比值，记作C·V，能够衡量数据偏离平均值的程度，由于变异系数为正值，因此需先将平均值绝对值化，再进行变异系数的计算。针对671 只个体所测得的光学指标分别计算每根羽毛3 次测量的指标之间的变异系数，之后计算变异系数的平均值，以变异系数的大小反映定量指标的稳定性。

1.4.4 估计结构色定量指标的遗传力的计算

（1）系谱与计算方法的获取

由于671 只黑羽鸡个体之间中既有半同胞也有全同胞关系，并且具体系谱已知，本研究选择单元内混合家系相关法[13]（将单元内同胞相关法与混合家系亲缘相关法进行融合）进行遗传力的估计，这样既能消除环境差异，又能在全同胞和半同胞资料同时存在时取一个合理的加权值[14]。

（2）遗传力的估计与显著性检验

对671 只黑羽鸡次级大覆羽的羽毛表型数据a 值与b 值以及系谱数据进行整理，再利用单元内混合家系相关法计算候选指标的遗传力，并使用t 检验进行遗传力的显著性检验。

2 结果

2.1 结构色定量指标和采集部位的筛选

在对5 只黑羽鸡羽毛的6 个指标经过数据分析之后，由图3 可知，虽然除了L 值以外，其他5 个指标在结构色强弱两组之间都表现出了显著差异，其中a 值和b 值能以0 为界限分为两组，有利于根据数值对羽毛进行分类，但其他指标不具有明显的数值界限，因此a 值和b 值更能够反映羽毛结构色强弱程度。

图3 对结构色定量指标的筛选
Fig.3 Selection of quantitative parameters of structural color

注：Group A（n=8）为有明显结构色组，Group B（n=7）为无明显结构色组。
Note:Group A(n=8)is the group with obvious structural color,Group B(n=7)is the group without obvious structural color.

2.2 羽毛采集部位的筛选

通过对3 个部位（鞍羽、次级大覆羽、肩羽）的a 值与b 值的依次比较，由图4 可知，虽然除了鞍羽b 值以外，3 个部位的a 值、b 值在结构色强弱两组之间都表现出了显著差异，但次级大覆羽部位的差异最为显著。即整体结构色比较明显的个体，次级大覆羽也往往会表现出显著的结构色；而整体结构色不明显的个体，次级大覆羽一般也不会表现出明显的结构色。而整体与其余两个部位的这种关系就相对弱一些。

图4 对结构色采样部位的选择
Fig.4 Selection of sampling site of structural colors

注：a 值与b 值指Lab 色彩模型中的指标。Group1（n=9）为有明显结构色组，Group2（n=6）为无明显结构色组。横坐标为分组，A、D 两图纵坐标为鞍羽所测得的a 值和b 值，B、E 两图纵坐标为次级大覆羽所测得的a 值和b 值，C、F 两图纵坐标为肩羽所测得的a 值和b 值。两组之间差异越显著，则该部位所测指标越能区分整体羽毛结构色的强弱程度。
Note:The “a” value and “b” value refer to the parameters in the Lab color space.Group 1(n=9)is the color group with obvious structure,and Group 2(n=6)is the color group without obvious structure.The X-axes are the grouping.The Y-axes of the A and D figures are the “a” value and“b” value measured by the saddle feather,respectively.The Y-axes of the B and E figures are the “a” value and “b” value measured by the secondary wing bar,respectively.Y-axes of the C and F figures are the “a” value and “b” value measured by the shoulder feathers,respectively.The more significant differences between the two groups were observed,the better the parameters measured in the body regions can distinguish the strength of the overall feather structural color.

2.3 群体a 值和b 值的数据分布和正态性检验

由图5 可知，对a 值和b 值进行正态分布的适合性检验结果均为P＜0.05，这说明a 值和b值均不符合正态分布。

图5 黑鸡次级大覆羽的a 值和b 值的数据分布（n=671）
Fig.5 Histogram of data distribution of the " a" value and " b" value of the secondary wing bar feather from black chickens (n=671)

2.4 定量指标稳定性的评判方法，遗传力的计算和显著性检验

由表1 可知，相比于b 值，a 值的变异系数较大，说明同b 值相比，a 值在同一羽毛内的变异较大，即a 值的不稳定性较高，而b 值稳定性则相对较好。

表1 黑鸡次级大覆羽的a 值和b 值统计（n=671）
Table 1 Statistics of the " a" value and " b" value of the secondary wing bar feather from black chickens（n=671）

注：±SD 表示测定数据的平均值±标准差，C·V 表示变异系数的平均值，h2 表示狭义遗传力，P 表示遗传力的显著性水平。
Note: ±SD represents the mean ± standard deviation of the parameters,C·V represents the mean of the coefficient of variation,h2 represents the narrow-sense heritability,and P represents the significance level of heritability.

同时，两个定量指标均表现出显著的遗传力，其中a 值的遗传力为0.235，为中等遗传力；b 值的遗传力为0.486，为高遗传力，预计采用个体选择的策略将会有较大的选育进展，因此b 值可能更适合作为遗传育种的选择性状。

3 讨论

3.1 家鸡结构色的定量检测方法

本课题组前期尝试了对鸡只进行相机拍照[15]、录像、暗室拍照等图像采集方法，但图片易受到现场光线、拍摄角度的影响，经过多次试验，最终选择了使用扫描仪对单根羽毛[16]进行扫描的方法来获取电子图片并使用取色软件进行分析，虽然此种方法受限制程度低，但步骤仍然很繁琐，难以在鸡舍现场获得表型数据并进行直接选淘，将在后续家禽结构色的研究当中逐渐改善检测方法，以期建立不依赖于计算机的更直接的结构色测定方法。

3.2 羽毛采样部位

本研究表明，次级大覆羽的结构色更能够反映鸡只整体结构色的强弱。覆羽是覆盖在飞羽基部的小型羽毛。其中覆于初级飞羽的基部的部分称为初级覆羽；覆于次级飞羽基部的称为次级覆羽，而次级覆羽可以明显的分为3 层，从外到内依次是次级小覆羽、次级中覆羽和次级大覆羽。在野生型羽色的公鸡中，次级大覆羽是表现出明显结构色的部位。在家鸭中也是如此，家鸭翅膀中由次级飞羽和翼上大覆羽形成的具有特定颜色的区域称作镜羽或翼镜，如绿头鸭具有蓝绿色翼镜，针尾鸭具有暗铜绿色翼镜，赤颈鸭具有暗灰褐色翼镜。因此本研究的结果与多种家禽中的典型表型吻合。为什么在众多翼羽中只有大覆羽这一小片区域在结构色的表达方面比较特殊，而且该特殊性还在不同家禽物种之间保守，针对该问题后续可在同一个体的不同羽毛区域进行转录组比较，以期获得结构色分子机制的线索。

3.3 黑鸡羽毛a 值和b 值的分布

根据图4，所有671 羽个体的a 值接近正态分布，集中于0 附近，从-4.3 到3.7 均有分布；b值也同样接近正态分布，集中于-0.4，从-4.1 到4.4 均有分布。因此群体中羽毛a 值与b 值的遗传也可能是多个微效基因的效应累加的结果。此外，从a 值的分布来看，偏红色（正值）的羽毛有大约一半，而b 值正值（偏黄色）的羽毛占比相对较少，推测红色是由褐黑色素产生的。因此本研究猜想，褐黑色素的存在可能对结构色的产生具有负面效应，而之前的研究仅探索了黑色素含量与结构色的关系[10]，未单独探究褐黑色素或真黑色素与结构色这一性状的关系，这也是未来值得去调查的一个研究方向。

3.4 针对结构色选育方案的讨论

本研究建立了数学模型，利用单元内混合家系相关法对反映结构色的a 值和b 值进行了遗传力估计。结果显示，a 值的遗传力为中等遗传力，而b 值的遗传力为高遗传力（表1）。同时，b 值在同一个根羽毛的3 次测定值之间的变异较小，表明其比a 值受到的非遗传因素干扰较小。因此从选择进展的角度来讲，b 值的选择效果可能要优于a 值，且根据数量遗传学原理，高遗传力的性状适合采用个体选择的方式。然而，是否仅针对b 值进行选择就能够获得理想结构色的个体，抑或是会获得偏蓝但不偏绿的 “另类” 结构色，这一点还需要在今后的育种实践中进行确认。

由于荆门黑羽绿壳蛋鸡是蛋鸡品种，因此结构色的经济价值主要体现在作为淘汰蛋鸡进行活鸡销售的母鸡上，所以本研究仅关注了母鸡的羽毛结构色。但在育种实践中，公鸡具有更丰富的结构色，且留种率更低，因此针对公鸡结构色的选育方案将是下一步要着重解决的问题。因为已知鸟类的结构色与其性二态性有紧密的联系，因此公鸡的结构色形成机制有可能与母鸡有较大差异。此外，如果在蛋鸡群体中对结构色进行选育，该性状与产蛋性能等传统经济性状之间是否存在遗传相关将是下一步亟待解决的问题。

4 结论

本研究建立的对家鸡羽毛结构色的定量检测方法如下：采集成年个体的次级大覆羽一枚，粘贴于白纸上用扫描仪进行扫描，运用Lab 色彩模型对获得的电子图片中的羽毛中上部进行多次取色，每根羽毛的a 值、b 值的均值即为该个体的两个结构色定量指标。

对该指标进行分析得知，结构色这一性状的遗传基础可能更偏向于微效多基因。a 值的狭义遗传力估计为0.235，为中等遗传力；b 值的狭义遗传力估计为0.486，为高遗传力。b 值的遗传力与测定稳定性均高于a 值，因此在对结构色进行选种的过程中，使用b 值的遗传进展可能要优于a 值。在后续研究中，结构色的测量方法将会继续得到完善，并将对结构色的遗传机制进行更深一步的研究，从而实现选育家鸡羽毛结构色的育种实践应用。

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