文献解读丨利用Cas12iMax进行家畜多基因编辑以提高家畜肌肉产量及抗病能力

2024-11-23 21:52 北京

1 研究背景

Cas12i^Max是利用蛋白质协同技术（MIDAS）从野生型Cas12i改造而来的基因编辑工具，该工具与广泛使用的AsCasl2a、BhCas12b、SpCas9、SaCas9和SaCas9-KKH等相关基因组编辑器相比，表现出更强大的基因编辑活性。更重要的是，Cas12i^Max是本国科学家的研究成果，拥有自主知识产权。

2 研究结果

2.1 Cas12i^Max在家畜成纤维细胞中的编辑效率

本文首先在猪的MSTN基因第二外显子上设计12个靶向crRNA，同时在相同区段设计12个与SpCas9对应的sgRNA用来作为试验的阳性参考，进行基本切割效率对比（图1A）。将构建好的质粒分别转染猪成纤维细胞，72h后收取细胞进行PCR检测，初步判定indel值，进行sanger测序进一步精确检测每个质粒的indel效率（图1B）。研究表明，Cas12i^Max在猪基因组的部分区段的indel效率与广泛使用的SpCas9效率相当或者更高。之后，为了检测Cas12i^Max在猪、牛和羊基因组中不同基因区段的编辑效率，作者选择巴马小型猪、蒙古牛和绵羊的成纤维细胞系为研究对象，分别靶向猪ANPEP、CD163和MSTN，牛CD18、PRNP和MSTN；羊BCO2、HYAL2和BLG，每个基因分别设计4-6个crRNA。图1C结果显示利用Cas12i^Max在猪、牛和羊基因组的不同基因位点设计的所有crRNA都有切割活性，进一步证明了Cas12iMax在猪、牛和羊基因组中保持高效基因编辑能力。同时检测了Cas12i^Max和Cas12i^HiFi在家畜成纤维细胞中的indel效率，图1D的结果说明在猪、牛和羊成纤维细胞中，高保真的Cas12i^HiFi效率比Cas12i^Max低约8%-19%。

为了阐明Cas12i^Max在3种家畜基因编辑中的特点，作者统计了Cas12i^Max在家畜成纤维细胞中产生的indel片段大小。同时将Cas12i^Max和SpCas9产生的indel序列数据进行对比，结果显示，Cas12i^Max会倾向于产生更长片段的缺失（图1E），原因可能是在基因敲除或者小的基因片段替换的相关研究中发挥更高效的作用。

为了检测Cas12i^Max在猪、牛和羊基因组中的适用编辑位点，将NCBI数据库中已经公布的猪（Sus scrofaassembly 11）、牛（Bos taurus UMD 4.0.1）和羊（Ovis aries version 4）全基因组数据进行位点综合分析，分别统计分析了5`-TTN和3`-NGG的位点数量，分别代表Casl2i^Max和SpCas9。结果表明。猪和牛的Cas12i^Max适用位点多于SpCas9，结果提示Cas12i^Max在部分家畜的基因编辑中具有更广的应用前景（图1F）。

图1 检测Cas12i^Max在家畜成纤维细胞中的编辑效率

2.2 通过Cas12i^Max制备ANPEP、CD163、MSTN和IGF2基因编辑猪

本文以该实验室之前所获得的IGF2^{IVF Indels}耳缘细胞系为材料，进行了4基因编辑猪构建。首先对已有的 IGF2^{IVF Indels}基因位点编辑猪的基因型进行了检测，然后建立了原代耳缘细胞系。接着将crRNA和Cas12i^Max质粒共转染到IGF2^{IVF Indels}耳缘细胞系中，72 h后进行流式分选，将转染后的细胞筛选成单克隆细胞到96孔板中，经过7-10d的培养，将单克隆细胞系传代到48孔板中，再经过2-5d的培养待细胞长满后继续传代到24孔板中，继续培养等细胞长满后冻存细胞，留少许到15mL离心管中待鉴定。通过PCR、T7E1酶切和sanger测序确认细胞系的基因型。对确定基因型的细胞进行体细胞克隆，然后挑选合适受体母猪进行胚胎移植，在胚胎移植30d左右通过B超确认受体猪的妊娠情况，之后对出生的动物模型进行表型检测（图2A和2B）。为进一步确认所筛选的细胞系是否为4基因编辑，首先检测了IGF2的基因型，图2C的测序结果显示基因型是（-131bp和-148bp）覆盖了第3内含子3062的位点。通过PCR和Sanger测序检测了所构建细胞系的基因型，其中：ANPEP靶片段敲除184bp，CD163缺失31bp，MSTN靶片段敲除16 bp（图2D）。通过检测最终筛选P-ACMG-21号细胞系进行进一步的核型分析和脱靶检测。核型分析时随机选择了10个细胞进行核型的统计分析，图2E结果显示10个细胞的核型都正常，没有发生染色体组级别的突变。接着，用软件预测了3个基因使用的crRNA的PAMS为5'-TTN的脱靶位点，进行了脱靶检测，结果显示：预测的11个脱靶位点都没有发生突变（图2F和2G），以上结果表明所筛选得到的4基因编辑细胞系不会因为多基因编辑发生可检测到的脱靶。

图2 四基因编辑猪制备

2.3 通过Cas12i^Max制备MSTN、PRNP和CD18基因编辑牛细胞系

本文对MSTN、PRNP和CD18基因序列分别设计了5到6个crRNA，并在细胞水平上测试，图3A为3个基因特定位点示意图。在蒙古牛细胞系中同时编辑3个基因，并对其进行测序以确定其基因型，图3B为测序结果图。为进一步检测所筛选到的3基因编辑牛细胞系是否在基因编辑过程中发生染色体级别的脱靶，作者对筛选到的3基因编辑细胞系进行了核型分析，通过对随机选择的13个细胞进行统计，结果显示92.8%的核型正常，而对照组未进行基因编辑操作的牛细胞系有92.3%的核型正常（图3C）。检测了细胞系筛选中使用的crRNA的脱靶位点，以5-TTN为PAMS进行了预测，结果显示没有检测到脱靶现象（图3D和3E）。

图3 三基因编辑牛细胞系制备

3 研究结论

本文为了验证多基因在大型动物中编辑的效率和可行性，作者采用家畜成纤维细胞的转染等多种生物学技术，对Cas12i^MAX的基础特性进行验证；利用Cas12i^MAX制备了生长速率快，肌肉产量高，以及对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和流行性腹泻病毒（TGEV）具有抵抗力的4基因编辑猪，并进行表型验证；同时，制备了肌肉产量高，对经典海绵状脑病（BSE）和曼海姆溶血杆菌感染引起的急性肺炎有抵抗能力的的3基因编辑蒙古牛胚胎。本文揭示了Cas12i^Max在家畜基因编辑过程中的有效性，并证明了Cas12i^Max的应用潜力。

来源：肉牛生物育种

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